Różnica między skoncentrowanym żelem a żelem separacyjnym
Wartość pH stężonego żelu różni się od wartości pH żelu rozdzielającego.Ten pierwszy pokazuje głównie efekt koncentracji, podczas gdy drugi pokazuje efekt ładunku i efekt sita molekularnego.Efekt koncentracji dopełnia się głównie w stężonym żelu.pH stężonego żelu wynosi 6,8.W tych warunkach pH prawie wszystkie jony Cl HCl w buforze ulegają dysocjacji, a punkt izoelektryczny Gly wynosi 6,0.Tylko nieliczne ulegają dysocjacji na jony ujemne, które poruszają się bardzo wolno w polu elektrycznym.Białka kwaśne dysocjują przy tym pH na jony ujemne, a szybkość migracji trzech rodzajów jonów wynosi cl > Białka ogólne > Gly.Po rozpoczęciu elektroforezy jony Cl poruszają się szybko, pozostawiając za sobą obszar o niskim stężeniu jonów.Gly porusza się bardzo wolno w polu elektrycznym, co skutkuje brakiem poruszających się jonów, więc między szybkimi i wolnymi jonami powstaje obszar wysokiego napięcia pozbawiony jonów.Wszystkie jony ujemne w obszarze wysokiego napięcia przyspieszą swój ruch.Kiedy przechodzą do obszaru jonów Cl, wysokie napięcie zanika, a prędkość poruszania się białka spada.Po ustaleniu powyższego stanu stabilnego próbka białka jest zatężana pomiędzy szybkimi i wolnymi jonami, tworząc wąską warstwę pośrednią. Jest ona ułożona w pasma zgodnie z ilością ładunku ujemnego przenoszonego przez białko.Po wprowadzeniu zatężonej próbki do żelu separacyjnego od zatężonego żelu pH żelu wzrasta, stopień dysocjacji Gly wzrasta, a ruchliwość wzrasta.Co więcej, ponieważ jego cząsteczka jest mała, przewyższa wszystkie cząsteczki białka.Natychmiast po migracji jonów Cl niskie stężenie jonów już nie występuje, tworząc stałą siłę pola elektrycznego.Dlatego separacja próbek białek w żelu separacyjnym zależy głównie od jego właściwości ładunkowych, wielkości i kształtu cząsteczek.Rozmiar porów żelu separacyjnego ma określony rozmiar.W przypadku białek o różnej masie względnej efekt histerezy uzyskiwany podczas przejścia jest inny.Nawet cząstki o równych ładunkach elektrostatycznych będą oddzielać od siebie białka o różnej wielkości dzięki działaniu tego sita molekularnego.
Różnica między 10% a 12% kleju rozdzielającego
W zależności od masy cząsteczkowej docelowego białka, jeśli jest to białko o większej masie cząsteczkowej (powyżej 60 kD), można użyć 10% kleju, jeśli jest to białko o masie cząsteczkowej między 60 a 30 kD, można użyć 12 % kleju, a jeśli jest niższy niż 30 kd, zwykle używam kleju 15%.Najważniejsze jest to, że kiedy linia wskaźnika po prostu kończy się na gumowym dnie, twoje docelowe białko może znajdować się dokładnie w środku gumy.
Wielkość porów żelu odpowiadająca różnym stężeniom żelu jest również różna.Rozmiar porów przy małym stężeniu jest duży, a rozmiar porów przy dużym stężeniu jest mały.Ogólnie rzecz biorąc, żel separacyjny wynosi 12%, a skoncentrowany żel 5%, ponieważ celem skoncentrowanego żelu jest skoncentrowanie wszystkich białek na tej samej linii początkowej, a następnie wejście do żelu separacyjnego w celu rozdzielenia.W zależności od wielkości białka.
Czas postu: 05-09-2022
