বিচ্ছেদ আঠালো কিভাবে ব্যবহার করবেন?
ওয়েস্টার্ন ব্লট মেমব্রেন ট্রান্সফার
কারেন্টের ক্রিয়ায়, প্রোটিন জেল থেকে কঠিন ক্যারিয়ারে (ঝিল্লি) স্থানান্তরিত হয়।
ঝিল্লি নির্বাচন: ছাপ তৈরিতে সাধারণত ব্যবহৃত সলিড-ফেজ উপাদানগুলির মধ্যে রয়েছে NC ঝিল্লি, DBM, DDT, নাইলন ঝিল্লি, PVDF, ইত্যাদি। আমরা PVDF (পলিভিনিলাইডিন ফ্লোরাইড) বেছে নিই, যার প্রোটিন শোষণ, শারীরিক শক্তি এবং আরও ভাল রাসায়নিক সামঞ্জস্য রয়েছে।দুটি স্পেসিফিকেশন আছে: immobilon-p (0.45um) এবং immobilon PSQ (MW <20kDa এর জন্য 0.2um)।
একটি আধা শুকনো পদ্ধতি
অর্থাৎ, জেল ইন্টারলেয়ার সংমিশ্রণটি স্থানান্তর বাফার সহ ফিল্টার পেপারের মধ্যে স্থাপন করা হয় এবং স্থানান্তর প্রভাব অর্জনের জন্য ফিল্টার পেপারে শোষণ করা বাফারের মাধ্যমে কারেন্ট পরিচালিত হয়।কারণ বর্তমান ফিল্ম আঠালো সরাসরি কাজ করে, স্থানান্তর শর্ত তুলনামূলকভাবে কঠোর, কিন্তু স্থানান্তর সময় কম এবং দক্ষতা বেশি।
(1) পরীক্ষামূলক অবস্থার নির্বাচন
কারেন্ট হল 1ma-2ma/cm2, এবং আমরা সাধারণত 100mA/মেমব্রেন ব্যবহার করি।স্থানান্তর সময় লক্ষ্য প্রোটিন অণুর আকার এবং জেল ঘনত্ব অনুযায়ী নির্বাচন করা যেতে পারে, এবং প্রকৃত পরিস্থিতি অনুযায়ী যথাযথভাবে সামঞ্জস্য করা যেতে পারে।
লক্ষ্য প্রোটিন আণবিক আকার (kDa), জেল ঘনত্ব এবং স্থানান্তর সময়
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10% 1.5
15-40 12% 0.75
<20 15% 0.5
(2) পরীক্ষামূলক অপারেশন
(1) ফিল্টার পেপার এবং মেমব্রেন তৈরি করা (ইলেক্ট্রোফোরসিসের 20 মিনিট আগে প্রস্তুতি শুরু করতে হবে)।
উ: পর্যাপ্ত স্থানান্তর বাফার আছে কিনা তা পরীক্ষা করুন, যা অবিলম্বে প্রস্তুত করা হয় না।
B. সঠিক আকারের ফিল্টার পেপার এবং মেমব্রেন আছে কিনা পরীক্ষা করুন।
C. প্রায় 1-2 মিনিটের জন্য মেথানলে ঝিল্লি ডুবিয়ে রাখুন।এবং তারপর স্থানান্তর বাফারে স্থানান্তরিত হয়।
D. স্থানান্তর বাফারে যথাক্রমে উপযুক্ত আঠালো ফিল্টার পেপার এবং মেমব্রেন ফিল্টার পেপার ভিজিয়ে রাখুন।
স্থানান্তর বাফারে প্রবেশ করার সময় পিডিভিএফ ঝিল্লি কতক্ষণ মিথানলে ভিজিয়ে রাখা উচিত?
PVDF হাইড্রোফোবিক, এবং স্থানান্তর বাফারে ভিজানো কঠিন।মিথানল চিকিত্সার পরে, এটি ভিজিয়ে রাখা সহজ।PVDF এর প্রিট্রিটমেন্ট হল মিথানল দিয়ে ভিজিয়ে এবং সক্রিয় করা, এবং তারপর ভালভাবে ভিজিয়ে রাখার পর পাতিত জল দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা।মিথানল বুদবুদ ব্যবহারের উদ্দেশ্য হল PVDF ঝিল্লিতে ইতিবাচক চার্জযুক্ত গ্রুপগুলিকে সক্রিয় করা এবং নেতিবাচক চার্জযুক্ত প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ করা সহজ করা।
লোকেরা সাধারণত এটি 5-20 মিনিটের জন্য ব্যবহার করে।আঠা নেওয়ার সাথে সাথে এটি ভিজিয়ে রাখা যেতে পারে এবং এটি অনুমান করা হয় যে এটি প্রায় 5 মিনিট সময় নেবে।প্রভাব খারাপ নয়।অতীতে, কিছু ওয়েবফ্রেন্ড পোস্ট করেছিল যে প্রক্রিয়াকরণের সময় খুব বেশি গুরুত্বপূর্ণ নয়, তবে মূল বিষয় ছিল চলচ্চিত্রের গুণমান।সেটা সত্য.যতক্ষণ না ঝিল্লি সম্পূর্ণভাবে ভিজে যায়, ততক্ষণ এটি ঠিক থাকতে হবে।
হাইবন্ডের PVDF স্পেসিফিকেশনটি নিম্নরূপ: "100% মেটানলে (10 সেকেন্ড) ঝিল্লিকে ভিজিয়ে রাখা"।আমার বোধগম্য হল যে এটি অন্তত 10 সেকেন্ডের জন্য ভিজিয়ে রাখা ঠিক আছে।আসলে, 10 সেকেন্ড বা 10 মিনিটের জন্য ভিজিয়ে রাখা ঠিক আছে।
(2) স্থানান্তর
উ: বৈদ্যুতিক স্থানান্তর যন্ত্রের উপর নীচের ফিল্টার কাগজ রাখুন।সাধারণত তিনটি স্তর ব্যবহার করা হয়।
B. ঝিল্লির বিপরীতে ফিল্টার পেপারে ঝিল্লি রাখুন, ঝিল্লি এবং ফিল্টার পেপারের মধ্যে বুদবুদ যাতে না থাকে সেদিকে মনোযোগ দিন এবং ঝিল্লি ভেজা রাখার জন্য ঝিল্লিতে কিছু স্থানান্তর বাফার ঢেলে দিন।
C. আঠালো খোসা ছাড়ুন, স্ট্যাক জেলটি সরিয়ে ফেলুন এবং সাবধানে ফিল্মের দিকে নিয়ে যান।
D. ফিল্মের উপরের বাম কোণ থেকে কেটে ফেলুন এবং একটি পেন্সিল দিয়ে ফিল্মের আঠালো অবস্থান চিহ্নিত করুন৷
E. আঠালো আঠার বিরুদ্ধে ফিল্টার পেপারের একটি টুকরা ঢেকে দিন।কিছু স্থানান্তর বাফার ঢালা এবং ফিল্টার কাগজ দুই টুকরা রাখা.
F. বৈদ্যুতিক স্থানান্তর যন্ত্র ইনস্টল করুন এবং প্রয়োজন অনুযায়ী প্রয়োজনীয় বর্তমান এবং সময় নির্বাচন করুন।
G. স্থানান্তর প্রক্রিয়া চলাকালীন, ভোল্টেজের পরিবর্তন যে কোনো সময় পরিলক্ষিত হবে, এবং যেকোনো অস্বাভাবিকতা সময়মতো সমন্বয় করা হবে।
পোস্টের সময়: সেপ্টেম্বর-০৭-২০২২
