Как использовать разделительный клей?- часть 1

Как использовать разделительный клей?

Перенос мембраны вестерн-блоттинга

Под действием тока белок переносится из геля на твердый носитель (мембрану).

Выбор мембраны: обычно используемые твердофазные материалы для импринтинга включают мембрану NC, DBM, DDT, нейлоновую мембрану, PVDF и т. д. Мы выбираем PVDF (поливинилиденфторид), который обладает лучшей адсорбцией белка, физической прочностью и лучшей химической совместимостью.Имеются две спецификации: иммобилон-р (0,45 мкм) и иммобилон PSQ (0,2 мкм для молекулярной массы < 20 кДа).

полусухой способ

То есть гелевая межслойная комбинация помещается между фильтровальной бумагой с буфером для переноса, и ток проводится через буфер, адсорбированный на фильтровальной бумаге, для достижения эффекта переноса.Поскольку ток действует непосредственно на пленочный клей, условия переноса относительно жесткие, но время переноса короткое, а эффективность высокая.

(1) выбор экспериментальных условий

Ток 1ма-2ма/см2, а мы обычно используем 100мА/мембрана.Время переноса может быть выбрано в соответствии с размером молекулы целевого белка и концентрацией геля и может быть соответствующим образом отрегулировано в соответствии с реальной ситуацией.

Размер молекулы целевого белка (кДа), концентрация геля и время переноса

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) опытная эксплуатация

(1) Подготовка фильтровальной бумаги и мембраны (подготовку следует начинать за 20 минут до электрофореза).

A. Проверьте, достаточно ли буферов передачи, которые не готовятся сразу.

B. Проверьте наличие фильтровальной бумаги и мембраны подходящего размера.

C. Погрузите мембрану в метанол примерно на 1-2 минуты.А затем передаются в буфер передачи.

D. Замочите соответствующую клейкую фильтровальную бумагу и мембранную фильтровальную бумагу в переносном буфере соответственно.

Как долго мембрана PDVF должна вымачиваться в метаноле при вводе в буфер для переноса?

ПВДФ является гидрофобным, и его трудно пропитать буфером для переноса.После обработки метанолом легче замачивать.Предварительная обработка ПВДФ заключается в пропитке и активации метанолом, а затем после тщательной пропитки дважды промывкой дистиллированной водой.Целью использования пузырьков метанола является активация положительно заряженных групп на мембране PVDF и облегчение связывания с отрицательно заряженными белками.

Люди обычно используют его в течение 5-20 минут.Его можно замачивать одновременно с клеем, и предполагается, что это займет около 5 минут.Эффект не плохой.В прошлом некоторые веб-друзья писали, что время обработки не имеет большого значения, но ключевым фактором является качество пленки.Это правда.Пока мембрана полностью пропитана, все должно быть в порядке.

Спецификация Hybond PVDF гласит: «предварительно смочите мембрану 100% метанолом (10 секунд)».Насколько я понимаю, можно замочить хотя бы на 10 секунд.На самом деле, можно замочить на 10 секунд или 10 минут.

(2) Трансфер

A. Положите нижнюю фильтровальную бумагу на электрический инструмент для переноса.Обычно используются три слоя.

B. Положите мембрану на фильтровальную бумагу напротив мембраны, следите за тем, чтобы между мембраной и фильтровальной бумагой не было пузырьков, и налейте на мембрану немного буфера для переноса, чтобы мембрана оставалась влажной.

C. Снимите клей, удалите стопку геля и осторожно переместите его на пленку.

D. Отрежьте верхний левый угол пленки и отметьте карандашом место клея на пленке.

E. Накройте кусок фильтровальной бумаги против клея на клей.Налейте немного буфера для переноса и положите два куска фильтровальной бумаги.

F. Установите инструмент для электрического переноса и выберите требуемый ток и время в соответствии с потребностями.

G. Во время процесса передачи изменение напряжения должно наблюдаться в любое время, и любая аномалия должна быть своевременно устранена.