Kako koristiti ljepilo za razdvajanje?
Western blot prijenos membrane
Pod djelovanjem struje protein se prenosi iz gela na kruti nosač (membranu).
Odabir membrane: materijali čvrste faze koji se obično koriste u otiskivanju uključuju NC membranu, DBM, DDT, najlonsku membranu, PVDF itd. Odabiremo PVDF (poliviniliden fluorid), koji ima bolju adsorpciju proteina, fizičku snagu i bolju kemijsku kompatibilnost.Postoje dvije specifikacije: immobilon-p (0,45 um) i immobilon PSQ (0,2 um za MW < 20 kDa).
Polu suha metoda
To jest, kombinacija međuslojeva gela postavlja se između filtar papira s puferom za prijenos, a struja se provodi kroz pufer adsorbiran na filtar papiru kako bi se postigao učinak prijenosa.Budući da struja djeluje izravno na filmsko ljepilo, uvjeti prijenosa su relativno teški, ali je vrijeme prijenosa kratko, a učinkovitost visoka.
(1) izbor eksperimentalnih uvjeta
Struja je 1ma-2ma/cm2, a obično koristimo 100mA/membranu.Vrijeme prijenosa može se odabrati u skladu s veličinom ciljne proteinske molekule i koncentracijom gela te se može odgovarajuće prilagoditi prema stvarnoj situaciji.
Veličina ciljne molekule proteina (kDa), koncentracija gela i vrijeme prijenosa
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0,75
<20 15% 0,5
(2) eksperimentalni rad
(1) Priprema filter papira i membrane (pripremu započeti 20 minuta prije elektroforeze).
A. Provjerite ima li dovoljno međuspremnika za prijenos koji se ne pripremaju odmah.
B. Provjerite ima li filter papira i membrane odgovarajuće veličine.
C. Uronite membranu u metanol oko 1-2 minute.I zatim prebačen u međuspremnik za prijenos.
D. Namočite odgovarajući ljepljivi filter papir i membranski filter papir u pufer za prijenos.
Koliko dugo se PDVF membrana treba namakati u metanolu kada ulazi u pufer za prijenos?
PVDF je hidrofoban i teško ga je natopiti u puferu za prijenos.Nakon tretmana metanolom, lakše se namače.Predtretman PVDF-a je namakanje i aktiviranje metanolom, a zatim ga dvaput isperite destiliranom vodom nakon temeljitog namakanja.Svrha korištenja mjehurića metanola je aktiviranje pozitivno nabijenih skupina na PVDF membrani i olakšavanje vezanja s negativno nabijenim proteinima.
Ljudi ga obično koriste 5-20 minuta.Može se namakati istovremeno s uzimanjem ljepila, a procjenjuje se da će to trajati oko 5 minuta.Učinak nije loš.U prošlosti su neki web-prijatelji objavili da vrijeme obrade nije puno važno, ali da je ključna kvaliteta filma.To je istina.Sve dok je membrana potpuno natopljena, trebalo bi biti u redu.
Hybond PVDF specifikacija glasi kako slijedi: "prethodno navlažite membranu u 100% metanolu (10 sekundi)".Koliko razumijem, u redu je namakati se najmanje 10 sekundi.Zapravo, u redu je namakati se 10 sekundi ili 10 minuta.
(2) Prijenos
A. Položite donji filter papir na instrument za električni prijenos.Obično se koriste tri sloja.
B. Položite membranu na filter papir uz membranu, pazite da nema mjehurića između membrane i filter papira i ulijte malo pufera za prijenos na membranu kako bi membrana ostala vlažna.
C. Odlijepite ljepilo, uklonite naslage gela i pažljivo ga premjestite na film.
D. Odrežite gornji lijevi kut filma i olovkom označite položaj ljepila na filmu.
E. Pokrijte komad filter papira protiv ljepila na ljepilu.Ulijte malo prijenosnog pufera i položite dva komada filter papira.
F. Instalirajte instrument za električni prijenos i odaberite potrebnu struju i vrijeme prema potrebama.
G. Tijekom procesa prijenosa, promjena napona mora se promatrati u bilo kojem trenutku, a svaka abnormalnost mora se na vrijeme prilagoditi.
Vrijeme objave: 7. rujna 2022
