如何使用分離膠？- 第1部分

如何使用分離膠？

蛋白質印跡膜轉移

在電流的作用下，蛋白質從凝膠轉移到固體載體（膜）上。

膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等，我們選擇PVDF（聚偏氟乙烯），它具有更好的蛋白質吸附性、物理強度和更好的化學相容性。有兩種規格：immobilon-p (0.45um) 和 immobilon PSQ (0.2um for MW < 20kDa)。

一種半乾法

即凝膠夾層組合置於帶有轉印緩衝液的濾紙之間，通過吸附在濾紙上的緩衝液傳導電流，從而達到轉印效果。由於電流直接作用在薄膜膠上，轉印條件比較苛刻，但轉印時間短，效率高。

(1)實驗條件的選擇

電流為1ma-2ma/cm2，我們一般用100mA/膜。轉印時間可根據目的蛋白分子大小和凝膠濃度選擇，並可根據實際情況適當調整。

目標蛋白分子大小 (kDa)、凝膠濃度和轉移時間

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) 實驗操作

(1)濾紙和濾膜的準備(電泳前20分鐘開始準備)。

A.檢查是否有足夠的transfer buffer，沒有立即準備好。

B、檢查是否有尺寸合適的濾紙和濾膜。

C. 將膜浸入甲醇中約 1-2 分鐘。然後轉移到轉移緩衝區。

D. 將合適的粘性濾紙和膜濾紙分別浸入轉移緩衝液中。

PDVF 膜在進入轉印緩衝液時應在甲醇中浸泡多長時間？

PVDF 是疏水性的，很難浸泡在轉移緩衝液中。經過甲醇處理後，更容易浸泡。PVDF的前處理是先用甲醇浸泡活化，浸泡徹底後用蒸餾水洗滌兩次。使用甲醇氣泡的目的是激活 PVDF 膜上帶正電荷的基團，使其更容易與帶負電荷的蛋白質結合。

人們通常使用它 5-20 分鐘。可以和取膠水同時浸泡，估計需要5分鐘左右。效果還不錯。以前有網友發帖說處理時間不是很重要，關鍵是片子的質量。這是真的。只要膜完全浸濕，就可以了。

Hybond 的 PVDF 規格如下：“在 100% 甲醇中預潤濕膜（10 秒）”。我的理解是至少浸泡10秒就可以了。其實泡10秒、10分鐘就可以了。

(2) 轉移

A. 將下層濾紙放在電轉移儀上。一般採用三層。

B. 將膜靠在濾紙上，注意膜與濾紙之間不要有氣泡，並在膜上倒一些轉移緩衝液以保持膜濕潤。

C. 撕掉膠水，取出堆疊凝膠並小心地將其移到薄膜上。

D、將薄膜的左上角剪掉，用鉛筆在薄膜上標出塗膠位置。

E、蓋一張濾紙抵住膠水上的膠水。倒入一些轉移緩衝液並放置兩張濾紙。

F、安裝電轉換儀，根據需要選擇需要的電流和時間。

G、轉運過程中，應隨時觀察電壓變化，發現異常及時調整。