Sut i ddefnyddio glud gwahanu?- rhan 1

Sut i ddefnyddio glud gwahanu?

Trosglwyddo bilen blot gorllewinol

O dan weithred cerrynt, mae'r protein yn cael ei drosglwyddo o'r gel i'r cludwr solet (bilen).

Dewis bilen: mae'r deunyddiau cyfnod solet a ddefnyddir yn gyffredin wrth argraffu yn cynnwys bilen NC, DBM, DDT, bilen neilon, PVDF, ac ati Rydym yn dewis PVDF (fflworid polyvinylidene), sydd â gwell arsugniad protein, cryfder corfforol a gwell cydnawsedd cemegol.Mae dwy fanyleb: immobilon-p (0.45um) ac immobilon PSQ (0.2um ar gyfer MW < 20kDa).

Dull lled sych

Hynny yw, gosodir y cyfuniad interlayer gel rhwng y papur hidlo gyda'r byffer trosglwyddo, ac mae'r presennol yn cael ei gynnal trwy'r byffer wedi'i arsugnu ar y papur hidlo i gyflawni'r effaith drosglwyddo.Oherwydd bod y presennol yn gweithredu'n uniongyrchol ar y glud ffilm, mae'r amodau trosglwyddo yn gymharol llym, ond mae'r amser trosglwyddo yn fyr ac mae'r effeithlonrwydd yn uchel.

(1) dewis amodau arbrofol

Y presennol yw 1ma-2ma / cm2, ac rydym fel arfer yn defnyddio 100mA / bilen.Gellir dewis yr amser trosglwyddo yn ôl maint y moleciwl protein targed a'r crynodiad gel, a gellir ei addasu'n briodol yn ôl y sefyllfa wirioneddol.

Targedu maint moleciwlaidd protein (kDa), crynodiad gel ac amser trosglwyddo

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) gweithrediad arbrofol

(1) Paratoi papur hidlo a philen (rhaid dechrau paratoi 20 munud cyn electrofforesis).

A. Gwiriwch a oes digon o glustogau trosglwyddo, nad ydynt yn cael eu paratoi ar unwaith.

B. Gwiriwch a oes papur hidlo a philen o faint priodol.

C. Trochwch y bilen mewn methanol am tua 1-2 funud.Ac yna ei drosglwyddo i'r byffer trosglwyddo.

D. Mwydwch y papur hidlo gludiog priodol a'r papur hidlo pilen yn y byffer trosglwyddo yn y drefn honno.

Pa mor hir ddylai'r bilen PDVF socian mewn methanol wrth fynd i mewn i'r byffer trosglwyddo?

Mae PVDF yn hydroffobig, ac mae'n anodd socian yn y byffer trosglwyddo.Ar ôl triniaeth methanol, mae'n haws socian.Rhag-drin PVDF yw ei socian a'i actifadu â methanol, ac yna ei olchi ddwywaith â dŵr distyll ar ôl ei socian yn drylwyr.Pwrpas defnyddio swigod methanol yw actifadu'r grwpiau â gwefr bositif ar y bilen PVDF a'i gwneud hi'n haws rhwymo â phroteinau â gwefr negyddol.

Mae pobl fel arfer yn ei ddefnyddio am 5-20 munud.Gellir ei socian ar yr un pryd â chymryd y glud, ac amcangyfrifir y bydd yn cymryd tua 5 munud.Nid yw'r effaith yn ddrwg.Yn y gorffennol, postiodd rhai ffrindiau gwe nad oedd yr amser prosesu yn bwysig iawn, ond yr allwedd oedd ansawdd y ffilm.Mae hynny'n wir.Cyn belled â bod y bilen wedi'i socian yn llwyr, dylai fod yn iawn.

Mae manyleb PVDF Hybond yn darllen fel a ganlyn: "cyn gwlyb y bilen mewn 100% metanol (10 eiliad)".Fy nealltwriaeth i yw ei bod yn iawn i socian am o leiaf 10 eiliad.Mewn gwirionedd, mae'n iawn socian am 10 eiliad neu 10 munud.

(2) Trosglwyddo

A. Gosodwch y papur hidlo isaf ar yr offeryn trosglwyddo trydan.Yn gyffredinol, defnyddir tair haen.

B. Gosodwch y bilen ar y papur hidlo yn erbyn y bilen, rhowch sylw i beidio â chael swigod rhwng y bilen a'r papur hidlo, ac arllwyswch rywfaint o glustogi trosglwyddo ar y bilen i gadw'r bilen yn wlyb.

C. Piliwch y glud i ffwrdd, tynnwch y gel pentwr a'i symud yn ofalus i'r ffilm.

D. Torrwch gornel chwith uchaf y ffilm i ffwrdd a marciwch y sefyllfa glud ar y ffilm gyda phensil.

E. Gorchuddiwch ddarn o bapur hidlo yn erbyn y glud ar y glud.Arllwyswch rywfaint o glustogi trosglwyddo a gosodwch ddau ddarn o bapur hidlo.

F. Gosodwch yr offeryn trosglwyddo trydan a dewiswch y cerrynt a'r amser gofynnol yn unol â'r anghenion.

G. Yn ystod y broses drosglwyddo, rhaid arsylwi ar y newid foltedd ar unrhyw adeg, a rhaid addasu unrhyw annormaledd mewn pryd.