როგორ გამოვიყენოთ გამყოფი წებო?
ვესტერნ ბლოტის მემბრანის გადატანა
დენის მოქმედებით ცილა გელიდან გადადის მყარ მატარებელში (მემბრანაში).
მემბრანის შერჩევა: ბეჭდვისას ხშირად გამოყენებული მყარი ფაზის მასალები მოიცავს NC მემბრანას, DBM, DDT-ს, ნეილონის მემბრანას, PVDF და ა.შ.არსებობს ორი სპეციფიკაცია: immobilon-p (0.45um) და immobilon PSQ (0.2um for MW <20kDa).
ნახევრად მშრალი მეთოდი
ანუ გელის ფენების კომბინაცია მოთავსებულია ფილტრის ქაღალდს შორის გადაცემის ბუფერთან და დენი მიეწოდება ფილტრის ქაღალდზე ადსორბირებული ბუფერის მეშვეობით გადაცემის ეფექტის მისაღწევად.იმის გამო, რომ დენი პირდაპირ მოქმედებს ფირის წებოზე, გადაცემის პირობები შედარებით მკაცრია, მაგრამ გადატანის დრო მოკლეა და ეფექტურობა მაღალი.
(1) ექსპერიმენტული პირობების შერჩევა
დენი არის 1ma-2ma/cm2 და ჩვენ ჩვეულებრივ ვიყენებთ 100mA/მემბრანას.გადაცემის დრო შეიძლება შეირჩეს სამიზნე ცილის მოლეკულის ზომისა და გელის კონცენტრაციის მიხედვით და შეიძლება სათანადოდ დარეგულირდეს ფაქტობრივი სიტუაციის მიხედვით.
ცილის სამიზნე მოლეკულური ზომა (kDa), გელის კონცენტრაცია და გადაცემის დრო
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0.75
<20 15% 0.5
(2) ექსპერიმენტული ოპერაცია
(1) ფილტრის ქაღალდისა და მემბრანის მომზადება (მომზადება უნდა დაიწყოს ელექტროფორეზამდე 20 წუთით ადრე).
ა. შეამოწმეთ არის თუ არა საკმარისი გადაცემის ბუფერები, რომლებიც დაუყოვნებლივ არ მზადდება.
B. შეამოწმეთ არის თუ არა ფილტრის ქაღალდი და შესაბამისი ზომის მემბრანა.
გ. ჩაყარეთ გარსი მეთანოლში დაახლოებით 1-2 წუთის განმავლობაში.და შემდეგ გადატანილი გადაცემის ბუფერში.
D. დაასველეთ შესაბამისი წებოვანი ფილტრის ქაღალდი და მემბრანული ფილტრის ქაღალდი გადატანის ბუფერში, შესაბამისად.
რამდენ ხანს უნდა ჩავარდეს მეთანოლში PDVF მემბრანა გადაცემის ბუფერში შესვლისას?
PVDF არის ჰიდროფობიური და ძნელია გადატანის ბუფერში ჩაძირვა.მეთანოლით დამუშავების შემდეგ უფრო ადვილია გაჟღენთვა.PVDF-ის წინასწარი დამუშავება არის მისი გაჟღენთვა და გააქტიურება მეთანოლით, შემდეგ კი ორჯერ გარეცხვა გამოხდილი წყლით საფუძვლიანად გაჟღენთვის შემდეგ.მეთანოლის ბუშტების გამოყენების მიზანია PVDF მემბრანაზე დადებითად დამუხტული ჯგუფების გააქტიურება და უარყოფითად დამუხტულ ცილებთან შეკავშირების გამარტივება.
ადამიანები მას ჩვეულებრივ იყენებენ 5-20 წუთის განმავლობაში.მისი გაჟღენთვა შესაძლებელია წებოს აღებასთან ერთად და სავარაუდოა, რომ ამას დაახლოებით 5 წუთი დასჭირდება.ეფექტი არ არის ცუდი.წარსულში, ზოგიერთი ვებ მეგობარი აქვეყნებდა, რომ დამუშავების დროს დიდი მნიშვნელობა არ ჰქონდა, მაგრამ მთავარი იყო ფილმის ხარისხი.Მართალია.სანამ მემბრანა მთლიანად გაჟღენთილია, ის უნდა იყოს OK.
Hybond-ის PVDF სპეციფიკაცია ასე იკითხება: "წინასწარ დაასველეთ მემბრანა 100% მეტანოლში (10 წამი)".ჩემი გაგებით არის ის, რომ კარგია ადუღება მინიმუმ 10 წამით.ფაქტობრივად, კარგია 10 წამის ან 10 წუთის განმავლობაში გაჟღენთვა.
(2) ტრანსფერი
ა. ქვედა ფილტრის ქაღალდი დააფინეთ ელექტრო გადამცემ ინსტრუმენტზე.ჩვეულებრივ გამოიყენება სამი ფენა.
B. დააფინეთ მემბრანა ფილტრის ქაღალდზე მემბრანის წინააღმდეგ, მიაქციეთ ყურადღება, რომ მემბრანასა და ფილტრის ქაღალდს შორის არ იყოს ბუშტუკები და დაასხით მემბრანაზე გადასატანი ბუფერი, რათა მემბრანა სველი იყოს.
C. ამოიღეთ წებო, ამოიღეთ დასტა გელი და ფრთხილად გადაიტანეთ ფილმზე.
D. მოჭერით ფილმის ზედა მარცხენა კუთხე და ფანქრით მონიშნეთ წებოს პოზიცია ფილმზე.
E. დააფარეთ ფილტრის ნაჭერი წებოზე წებოს წინააღმდეგ.ჩაასხით გადაცემის ბუფერი და დადეთ ორი ცალი ფილტრის ქაღალდი.
F. დააინსტალირეთ ელექტროგადამცემი ინსტრუმენტი და შეარჩიეთ საჭირო დენი და დრო საჭიროების მიხედვით.
ზ. გადაცემის პროცესში ძაბვის ცვლილება ნებისმიერ დროს უნდა დაფიქსირდეს და ნებისმიერი დარღვევა დროულად დარეგულირდეს.
გამოქვეყნების დრო: სექ-07-2022
