Како да се користи лепак за одвојување?- дел 1

Како да се користи лепак за одвојување?

Трансфер на мембрана вестерн блот

Под дејство на струја, протеинот се пренесува од гелот до цврстиот носач (мембрана).

Избор на мембрани: најчесто користените цврсти фазни материјали при втиснување вклучуваат NC мембрана, DBM, DDT, најлонска мембрана, PVDF итн. Избираме PVDF (поливинилиден флуорид), кој има подобра адсорпција на протеини, физичка сила и подобра хемиска компатибилност.Постојат две спецификации: immobilon-p (0,45um) и immobilon PSQ (0,2um за MW <20kDa).

Полусув метод

Односно, комбинацијата на меѓуслојни гелови се поставува помеѓу филтер-хартијата со преносниот пуфер, а струјата се спроведува низ пуферот адсорбиран на филтер-хартијата за да се постигне ефектот на пренос.Бидејќи струјата делува директно на филмското лепило, условите за пренос се релативно сурови, но времето на пренос е кратко, а ефикасноста е висока.

(1) избор на експериментални услови

Струјата е 1ma-2ma / cm2, а ние обично користиме 100mA / мембрана.Времето на пренос може да се избере според големината на целната протеинска молекула и концентрацијата на гелот и може соодветно да се прилагоди во согласност со фактичката ситуација.

Целна молекуларна големина на протеин (kDa), концентрација на гел и време на трансфер

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15-40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) експериментална операција

(1) Подготовка на филтер-хартија и мембрана (подготовката се започнува 20 минути пред електрофореза).

A. Проверете дали има доволно бафери за трансфер, кои не се подготвуваат веднаш.

B. Проверете дали има филтер-хартија и мембрана со соодветна големина.

В. Потопете ја мембраната во метанол околу 1-2 минути.И потоа префрлен во тампон за трансфер.

Г. Потопете ја соодветната леплива филтер-хартија и мембранската филтер-хартија во префрлен пуфер соодветно.

Колку долго PDVF мембраната треба да се впие во метанол кога ќе влезе во баферот за пренос?

PVDF е хидрофобен и тешко е да се впие во баферот за пренос.По третманот со метанол, полесно е да се впие.Предтретманот на PVDF е да го натопите и активирате со метанол, а потоа двапати да го измиете со дестилирана вода по темелно натопување.Целта на користењето меурчиња од метанол е да се активираат позитивно наелектризираните групи на PVDF мембраната и да се олесни врзувањето со негативно наелектризираните протеини.

Луѓето обично го користат 5-20 минути.Може да се натопи истовремено со земањето на лепилото, а се проценува дека ќе трае околу 5 минути.Ефектот не е лош.Во минатото, некои веб-пријатели објавуваа дека времето за обработка не е многу важно, но клучот е квалитетот на филмот.Тоа е точно.Сè додека мембраната е целосно натопена, треба да биде во ред.

Спецификациите за PVDF на Hybond гласат на следниов начин: „пред навлажнете ја мембраната во 100% метанол (10 секунди)“.Моето разбирање е дека е во ред да се кисне најмалку 10 секунди.Всушност, во ред е да киснете 10 секунди или 10 минути.

(2) Трансфер

A. Поставете ја долната филтер-хартија на електричниот преносен инструмент.Обично се користат три слоја.

Б. Поставете ја мембраната на филтер-хартијата наспроти мембраната, внимавајте да нема меурчиња помеѓу мембраната и филтер-хартијата и истурете малку префрлен пуфер врз мембраната за да ја одржите мембраната влажна.

В. Излупете го лепилото, извадете го гелот од оџакот и внимателно преместете го на филмот.

D. Исечете го горниот лев агол на филмот и означете ја позицијата на лепилото на филмот со молив.

E. Покријте парче филтер-хартија против лепилото на лепилото.Истурете малку префрлен пуфер и поставете две парчиња филтер-хартија.

F. Инсталирајте го електричниот преносен инструмент и изберете ја потребната струја и време според потребите.

G. За време на процесот на пренос, промената на напонот треба да се набљудува во секое време и секоја абнормалност ќе се прилагоди навреме.