Unsaon paggamit ang separation glue?– bahin 1

Unsaon paggamit ang separation glue?

Pagbalhin sa Western blot membrane

Ubos sa aksyon sa kasamtangan, ang protina gibalhin gikan sa gel ngadto sa solid carrier (membrane).

Pagpili sa lamad: ang kasagarang gigamit nga solid-phase nga mga materyales sa pag-imprinta naglakip sa NC membrane, DBM, DDT, nylon membrane, PVDF, ug uban pa. Gipili namo ang PVDF (polyvinylidene fluoride), nga adunay mas maayo nga adsorption sa protina, pisikal nga kusog ug mas maayo nga kemikal nga pagkasibo.Adunay duha ka mga detalye: immobilon-p (0.45um) ug immobilon PSQ (0.2um alang sa MW <20kDa).

Usa ka semi-uga nga pamaagi

Sa ato pa, ang kombinasyon sa gel interlayer gibutang sa taliwala sa filter nga papel nga adunay transfer buffer, ug ang kasamtangan nga gihimo pinaagi sa buffer adsorbed sa filter nga papel aron makab-ot ang epekto sa pagbalhin.Tungod kay ang kasamtangan nga paglihok direkta sa papilit sa pelikula, ang mga kondisyon sa pagbalhin medyo mapintas, apan ang oras sa pagbalhin mubo ug ang kahusayan taas.

(1) pagpili sa mga kondisyon sa eksperimento

Ang kasamtangan mao ang 1ma-2ma / cm2, ug kasagaran namong gamiton ang 100mA / lamad.Ang oras sa pagbalhin mahimong mapili sumala sa gidak-on sa target nga molekula sa protina ug ang konsentrasyon sa gel, ug mahimong ipasibo sa tukma sumala sa aktuwal nga kahimtang.

Target nga gidak-on sa molekula sa protina (kDa), konsentrasyon sa gel ug oras sa pagbalhin

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) eksperimento nga operasyon

(1) Pag-andam sa filter nga papel ug lamad (pag-andam magsugod 20 minutos sa dili pa electrophoresis).

A. Susiha kung adunay igo nga mga buffer sa pagbalhin, nga wala maandam dayon.

B. Susiha kung adunay salaan nga papel ug lamad nga husto ang gidak-on.

C. Ituslob ang lamad sa methanol sulod sa mga 1-2 ka minuto.Ug dayon gibalhin sa pagbalhin buffer.

D. Ihumol ang angay nga adhesive filter paper ug membrane filter paper ngadto sa transfer buffer matag usa.

Hangtud kanus-a kinahanglan nga ang lamad sa PDVF mohumol sa methanol kung mosulod sa buffer sa pagbalhin?

Ang PVDF kay hydrophobic, ug lisud ang paghumol sa buffer sa pagbalhin.Human sa pagtambal sa methanol, mas sayon ​​ang paghumol.Ang pretreatment sa PVDF mao ang paghumol ug pagpaaktibo niini gamit ang methanol, ug dayon hugasan kini sa makaduha gamit ang distilled water human sa hingpit nga paghumol.Ang katuyoan sa paggamit sa mga bula sa methanol mao ang pagpaaktibo sa mga positibo nga gikargahan nga mga grupo sa PVDF lamad ug gipasayon ​​ang pagbugkos sa mga negatibo nga gikargahan nga mga protina.

Ang mga tawo kasagarang mogamit niini sulod sa 5-20 ka minuto.Mahimo kini nga matumog sa parehas nga oras sa pagkuha sa glue, ug gibanabana nga molungtad kini mga 5 minuto.Ang epekto dili daotan.Kaniadto, ang pipila ka mga higala sa web nag-post nga ang oras sa pagproseso dili hinungdanon, apan ang yawe mao ang kalidad sa pelikula.Tinuod na.Hangtud nga ang lamad hingpit nga matumog, kini kinahanglan nga OK ra.

Ang espesipikasyon sa PVDF sa Hybond mabasa sama sa mosunod: "pre wet the membrane in 100% metanol (10 seconds)".Ang akong pagsabot mao nga OK ra ang paghumol sa labing menos 10 ka segundos.Sa pagkatinuod, OK ra nga magbabad sulod sa 10 segundos o 10 minutos.

(2) Pagbalhin

A. Ibutang ang ubos nga filter nga papel sa electric transfer instrument.Kasagaran, tulo ka mga layer ang gigamit.

B. Ibutang ang lamad sa filter nga papel batok sa lamad, pagtagad nga dili adunay mga bula tali sa lamad ug sa filter nga papel, ug ibubo ang pipila ka pagbalhin buffer ngadto sa lamad aron magpabilin nga basa ang lamad.

C. Panit ang papilit, kuhaa ang stack gel ug ibalhin kini pag-ayo sa pelikula.

D. Guntinga ang ibabaw nga wala nga suok sa pelikula ug markahi ang posisyon sa papilit sa pelikula gamit ang lapis.

E. Tabuni ang usa ka piraso sa filter nga papel batok sa papilit sa papilit.Ibubo ang pipila ka transfer buffer ug ibutang ang duha ka piraso sa filter nga papel.

F. I-install ang electric transfer instrument ug pilia ang gikinahanglan nga kasamtangan ug oras sumala sa mga panginahanglan.

G. Atol sa proseso sa pagbalhin, ang pagbag-o sa boltahe kinahanglan nga maobserbahan sa bisan unsang oras, ug ang bisan unsang abnormalidad kinahanglan nga usbon sa oras.