Бөлүү клей кантип колдонсо болот?- 1-бөлүк

Бөлүү клей кантип колдонсо болот?

Вестерн-блот мембраналык трансфер

Токтун таасири астында белок гелден катуу алып жүрүүчүгө (мембранага) өтөт.

Мембрананы тандоо: басып чыгарууда кеңири колдонулган катуу фазалык материалдарга NC мембранасы, ДБМ, ДДТ, нейлон мембранасы, PVDF ж.б. кирет. Биз протеиндин жакшы адсорбциясы, физикалык күчү жана жакшы химиялык шайкештиги бар PVDF (polyvinylidene fluoride) тандайбыз.Эки спецификациясы бар: immobilon-p (0.45um) жана immobilon PSQ (MW < 20kDa үчүн 0.2um).

Жарым кургак ыкма

Башкача айтканда, гель аралык катмардын комбинациясы өткөрүп берүү буфери бар фильтр кагазынын ортосуна жайгаштырылат жана өткөрүү эффектине жетишүү үчүн агым чыпка кагазына адсорбцияланган буфер аркылуу өткөрүлөт.Ток түздөн-түз пленка желимине таасир эткендиктен, өткөрүү шарттары салыштырмалуу катаал, бирок өткөрүү убактысы кыска жана эффективдүүлүгү жогору.

(1) эксперименттик шарттарды тандоо

Учурдагы 1ma-2ma / см2, биз адатта 100mA / мембрананы колдонобуз.Өткөрүп берүү убактысы максаттуу белок молекуласынын өлчөмүнө жана гел концентрациясына жараша тандалып алынышы мүмкүн жана анык кырдаалга ылайык туура жөнгө салынышы мүмкүн.

Максаттуу протеиндин молекулалык өлчөмү (кДа), гелдин концентрациясы жана өткөрүү убактысы

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) эксперименталдык операция

(1) Фильтр кагазын жана мембрананы даярдоо (даярдоо электрофорезден 20 мүнөт мурун башталат).

A. Дароо даярдалбаган которуу буферлери жетиштүү экендигин текшериңиз.

B. Тийиштүү өлчөмдөгү чыпка кагазы жана мембрана бар же жок экенин текшериңиз.

C. Метанолго мембрананы болжол менен 1-2 мүнөткө батырыңыз.Анан которуу буферине которулат.

D. Тийиштүү жабышчаак чыпка кагазын жана мембрандык чыпка кагазын тиешелүү түрдө өткөрүп берүү буферине чылап коюңуз.

Трансфер буферине киргенде PDVF мембранасы метанолго канча убакыт сиңиши керек?

PVDF гидрофобдук болуп саналат жана аны өткөрүп берүү буферине сиңирүү кыйын.Метанол менен иштетилгенден кийин аны сиңирүү оңой болот.PVDF алдын ала тазалоо аны метанол менен чылап, активдештирүү, анан жакшылап чылап алгандан кийин дистилденген суу менен эки жолу жуу.Метанол көбүкчөлөрүн колдонуунун максаты - PVDF мембранасындагы оң заряддуу топторду активдештирүү жана терс заряддуу белоктор менен байланышты жеңилдетүү.

Адамдар аны көбүнчө 5-20 мүнөт колдонушат.Аны клей алуу менен бир убакта чылап койсо болот, болжол менен 5 мүнөттөй убакыт кетет.Эффект жаман эмес.Мурда айрым интернет достору процесстин убактысы анча деле мааниге ээ эмес экенин, бирок негизгиси тасманын сапаты экенин жазышкан.Бул чын.Качан гана мембрана толугу менен нымдалган, ал OK болушу керек.

Hybond's PVDF спецификациясында төмөнкүдөй жазылган: "мембрананы 100% метанолдо (10 секунд) алдын ала нымдоо".Менин түшүнүгүм боюнча, жок дегенде 10 секунд сууга чөмүлсө жакшы болот.Чынында, 10 секунд же 10 мүнөт сууга түшсө жакшы болот.

(2) өткөрүп берүү

A. Төмөнкү чыпка кагазын электр өткөргүч аспабына салыңыз.Көбүнчө үч катмар колдонулат.

B. Мембрананы чыпкалуу кагазга мембранага каршы коюп, мембрана менен чыпка кагазынын ортосунда көбүкчөлөрдүн болбошуна көңүл буруңуз жана мембрананы нымдуу кармоо үчүн мембранага бир аз трансфер буферин куюңуз.

C. Желимди чечип, стек гелин алып салыңыз жана аны кылдаттык менен пленкага жылдырыңыз.

D. Пленканын жогорку сол бурчунан кесип, пленкадагы клейдин ордун карандаш менен белгилеңиз.

E. желим боюнча желим каршы чыпка кагазынын бир бөлүгүн жаап.Трансфер буферин куюп, эки фильтр кагазын салыңыз.

F. электр өткөргүч аспапты орнотуу жана муктаждыктарына ылайык зарыл болгон учурдагы жана убакытты тандоо.

G. Өткөрүп берүү процессинде чыңалуунун өзгөрүшү каалаган убакта байкалышы керек, ал эми ар кандай аномалия өз убагында жөнгө салынышы керек.