Kiel uzi disiga gluo?
Western blot membrantranslokigo
Sub la agado de fluo, la proteino estas translokigita de la ĝelo al la solida portanto (membrano).
Membrana elekto: la komune uzataj solid-fazaj materialoj en presado inkluzivas NC-membranon, DBM, DDT, nilonan membranon, PVDF, ktp. Ni elektas PVDF (polivinilidena fluorido), kiu havas pli bonan proteinan adsorbadon, fizikan forton kaj pli bonan kemian kongruon.Estas du specifoj: immobilon-p (0.45um) kaj immobilon PSQ (0.2um por MW < 20kDa).
Duone seka metodo
Tio estas, la ĝela intertavola kombinaĵo estas metita inter la filtrila papero kun la translokiga bufro, kaj la fluo estas kondukita tra la bufro adsorbita sur la filtrila papero por atingi la translokan efikon.Ĉar la fluo agas rekte sur la filmo-gluo, la translokaj kondiĉoj estas relative severaj, sed la transiga tempo estas mallonga kaj la efikeco estas alta.
(1) elekto de eksperimentaj kondiĉoj
La fluo estas 1ma-2ma / cm2, kaj ni kutime uzas 100mA / membrano.La transiga tempo povas esti elektita laŭ la grandeco de la cela proteina molekulo kaj la ĝela koncentriĝo, kaj povas esti ĝustigita taŭge laŭ la reala situacio.
Celproteina molekula grandeco (kDa), ĝelkoncentriĝo kaj transiga tempo
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15—40 12 % 0,75
<20 15% 0,5
(2) eksperimenta operacio
(1) Preparado de filtrila papero kaj membrano (preparo devas komenciĝi 20 minutojn antaŭ elektroforezo).
R. Kontrolu ĉu estas sufiĉe da transiga bufroj, kiuj ne estas tuj pretaj.
B. Kontrolu ĉu estas filtrila papero kaj membrano de taŭga grandeco.
C. Mergu la membranon en metanolo dum ĉirkaŭ 1-2 minutoj.Kaj tiam translokigita al la translokiga bufro.
D. Trempu la taŭgan adhesivan filtrilpaperon kaj membran-filtrilpaperon en la transiga bufro respektive.
Kiom longe devus la PDVF-membrano trempi en metanolo enirante la transiga bufro?
PVDF estas hidrofoba, kaj estas malfacile trempi en la transiga bufro.Post metanola traktado, estas pli facile trempi.La antaŭtraktado de PVDF estas trempi kaj aktivigi ĝin per metanolo, kaj poste lavi ĝin dufoje kun distilita akvo post trempido ĝisfunde.La celo de uzado de metanolaj vezikoj estas aktivigi la pozitive ŝargitajn grupojn sur la PVDF-membrano kaj faciligi ligi kun negative ŝargitaj proteinoj.
Homoj kutime uzas ĝin dum 5-20 minutoj.Ĝi povas esti trempita samtempe ol preni la gluon, kaj oni taksas, ke ĝi daŭros ĉirkaŭ 5 minutojn.La efiko ne estas malbona.En la pasinteco, kelkaj retamikoj afiŝis ke la pretigtempo ne multe gravis, sed la ŝlosilo estis la kvalito de la filmo.Estas prave.Dum la membrano estas tute trempita, ĝi devus esti en ordo.
La PVDF-specifo de Hybond legas jene: "pre malsekigi la membranon en 100% metanolo (10 sekundoj)".Mia kompreno estas, ke estas bone trempi dum almenaŭ 10 sekundoj.Fakte, estas bone trempi dum 10 sekundoj aŭ 10 minutoj.
(2) Translokigo
A. Metu la malsupran filtrilan paperon sur la elektra transiga instrumento.Ĝenerale tri tavoloj estas uzataj.
B. Metu la membranon sur la filtrila papero kontraŭ la membranon, atentu ne havi bobelojn inter la membrano kaj la filtrila papero, kaj verŝu iom da translokiga bufro sur la membranon por konservi la membranon malseka.
C. Forigu la gluon, forigu la stakan ĝelon kaj zorge movu ĝin sur la filmon.
D. Fortranĉu la supran maldekstran angulon de la filmo kaj marku la gluan pozicion sur la filmo per krajono.
E. Kovru pecon da filtrila papero kontraŭ la gluo sur la gluo.Verŝu iom da transiga bufro kaj metu du pecojn da filtrila papero.
F. Instalu la elektran transigan instrumenton kaj elektu la bezonatajn fluon kaj tempon laŭ la bezonoj.
G. Dum la transiga procezo, la tensioŝanĝo devas esti observita en ajna momento, kaj ajna anomalio devas esti ĝustigita en tempo.
Afiŝtempo: Sep-07-2022
