Πώς να χρησιμοποιήσετε τη διαχωριστική κόλλα;- μέρος 1

Πώς να χρησιμοποιήσετε τη διαχωριστική κόλλα;

Μεταφορά μεμβράνης Western blot

Υπό τη δράση του ρεύματος, η πρωτεΐνη μεταφέρεται από το πήκτωμα στον στερεό φορέα (μεμβράνη).

Επιλογή μεμβράνης: τα υλικά στερεάς φάσης που χρησιμοποιούνται συνήθως στην αποτύπωση περιλαμβάνουν μεμβράνη NC, DBM, DDT, νάιλον μεμβράνη, PVDF κ.λπ. Επιλέγουμε PVDF (φθοριούχο πολυβινυλιδένιο), το οποίο έχει καλύτερη προσρόφηση πρωτεΐνης, φυσική αντοχή και καλύτερη χημική συμβατότητα.Υπάρχουν δύο προδιαγραφές: immobilon-p (0,45um) και immobilon PSQ (0,2um για MW < 20kDa).

Ημίξηρη μέθοδος

Δηλαδή, ο συνδυασμός ενδιάμεσης στιβάδας γέλης τοποθετείται μεταξύ του διηθητικού χαρτιού με το ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς και το ρεύμα διοχετεύεται μέσω του ρυθμιστικού διαλύματος που προσροφάται στο διηθητικό χαρτί για να επιτευχθεί το αποτέλεσμα μεταφοράς.Επειδή το ρεύμα δρα απευθείας στην κόλλα μεμβράνης, οι συνθήκες μεταφοράς είναι σχετικά σκληρές, αλλά ο χρόνος μεταφοράς είναι σύντομος και η απόδοση είναι υψηλή.

(1) επιλογή πειραματικών συνθηκών

Το ρεύμα είναι 1ma-2ma / cm2 και συνήθως χρησιμοποιούμε 100mA / μεμβράνη.Ο χρόνος μεταφοράς μπορεί να επιλεγεί ανάλογα με το μέγεθος του μορίου της πρωτεΐνης στόχου και τη συγκέντρωση της γέλης και μπορεί να ρυθμιστεί κατάλληλα ανάλογα με την πραγματική κατάσταση.

Μοριακό μέγεθος πρωτεΐνης στόχου (kDa), συγκέντρωση γέλης και χρόνος μεταφοράς

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) πειραματική λειτουργία

(1) Προετοιμασία διηθητικού χαρτιού και μεμβράνης (η προετοιμασία θα ξεκινήσει 20 λεπτά πριν την ηλεκτροφόρηση).

Α. Ελέγξτε εάν υπάρχουν αρκετά buffer μεταφοράς, τα οποία δεν προετοιμάζονται αμέσως.

Β. Ελέγξτε εάν υπάρχει διηθητικό χαρτί και μεμβράνη κατάλληλου μεγέθους.

Γ. Βυθίστε τη μεμβράνη σε μεθανόλη για περίπου 1-2 λεπτά.Και στη συνέχεια μεταφέρεται στο buffer μεταφοράς.

Δ. Μουσκέψτε το κατάλληλο αυτοκόλλητο διηθητικό χαρτί και το κατάλληλο διηθητικό χαρτί μεμβράνης στο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς αντίστοιχα.

Πόσο καιρό πρέπει να εμποτιστεί η μεμβράνη PDVF σε μεθανόλη κατά την είσοδο στο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς;

Το PVDF είναι υδρόφοβο και είναι δύσκολο να εμποτιστεί στο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς.Μετά την επεξεργασία με μεθανόλη, είναι πιο εύκολο να μουλιάσει.Η προεπεξεργασία του PVDF είναι να εμποτιστεί και να ενεργοποιηθεί με μεθανόλη και, στη συνέχεια, να πλυθεί δύο φορές με απεσταγμένο νερό αφού μουλιάσει καλά.Ο σκοπός της χρήσης φυσαλίδων μεθανόλης είναι να ενεργοποιηθούν οι θετικά φορτισμένες ομάδες στη μεμβράνη PVDF και να διευκολυνθεί η σύνδεση με αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες.

Οι άνθρωποι το χρησιμοποιούν συνήθως για 5-20 λεπτά.Μπορεί να μουλιαστεί ταυτόχρονα με τη λήψη της κόλλας και υπολογίζεται ότι θα χρειαστούν περίπου 5 λεπτά.Το αποτέλεσμα δεν είναι κακό.Στο παρελθόν, κάποιοι διαδικτυακοί φίλοι δημοσίευσαν ότι ο χρόνος επεξεργασίας δεν είχε μεγάλη σημασία, αλλά το κλειδί ήταν η ποιότητα της ταινίας.Αυτό είναι αλήθεια.Εφόσον η μεμβράνη είναι εντελώς εμποτισμένη, θα πρέπει να είναι εντάξει.

Η προδιαγραφή PVDF της Hybond έχει ως εξής: "προβρέχουμε τη μεμβράνη σε 100% μετανόλη (10 δευτερόλεπτα)".Καταλαβαίνω ότι είναι εντάξει να μουλιάζετε για τουλάχιστον 10 δευτερόλεπτα.Στην πραγματικότητα, είναι εντάξει να μουλιάσει για 10 δευτερόλεπτα ή 10 λεπτά.

(2) Μεταφορά

A. Τοποθετήστε το κάτω διηθητικό χαρτί στο ηλεκτρικό όργανο μεταφοράς.Γενικά χρησιμοποιούνται τρία στρώματα.

Β. Τοποθετήστε τη μεμβράνη πάνω στο διηθητικό χαρτί πάνω στη μεμβράνη, προσέξτε να μην υπάρχουν φυσαλίδες μεταξύ της μεμβράνης και του διηθητικού χαρτιού και ρίξτε λίγο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς στη μεμβράνη για να διατηρήσετε τη μεμβράνη υγρή.

Γ. Ξεφλουδίστε την κόλλα, αφαιρέστε τη γέλη της στοίβας και μετακινήστε την προσεκτικά πάνω στη μεμβράνη.

Δ. Κόψτε την επάνω αριστερή γωνία της μεμβράνης και σημειώστε τη θέση της κόλλας στη μεμβράνη με ένα μολύβι.

Ε. Καλύψτε ένα κομμάτι διηθητικό χαρτί πάνω στην κόλλα πάνω στην κόλλα.Ρίξτε λίγο buffer μεταφοράς και απλώστε δύο κομμάτια διηθητικό χαρτί.

ΣΤ. Τοποθετήστε το ηλεκτρικό όργανο μεταφοράς και επιλέξτε το απαιτούμενο ρεύμα και χρόνο ανάλογα με τις ανάγκες.

Ζ. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μεταφοράς, η αλλαγή τάσης πρέπει να παρατηρείται ανά πάσα στιγμή και οποιαδήποτε ανωμαλία θα ρυθμίζεται έγκαιρα.