വേർതിരിക്കൽ പശ എങ്ങനെ ഉപയോഗിക്കാം?
വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് മെംബ്രൺ ട്രാൻസ്ഫർ
നിലവിലെ പ്രവർത്തനത്തിൽ, പ്രോട്ടീൻ ജെല്ലിൽ നിന്ന് സോളിഡ് കാരിയറിലേക്ക് (മെംബ്രൺ) മാറ്റുന്നു.
മെംബ്രെൻ തിരഞ്ഞെടുക്കൽ: എൻസി മെംബ്രൺ, ഡിബിഎം, ഡിഡിടി, നൈലോൺ മെംബ്രൻ, പിവിഡിഎഫ് തുടങ്ങിയവയാണ് സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന സോളിഡ്-ഫേസ് മെറ്റീരിയലുകൾ. മികച്ച പ്രോട്ടീൻ ആഗിരണം, ശാരീരിക ശക്തി, മികച്ച രാസ അനുയോജ്യത എന്നിവയുള്ള PVDF (polyvinylidene fluoride) ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നു.രണ്ട് പ്രത്യേകതകൾ ഉണ്ട്: immobilon-p (0.45um), immobilon PSQ (MW <20kDa-ന് 0.2um).
ഒരു അർദ്ധ ഉണങ്ങിയ രീതി
അതായത്, ട്രാൻസ്ഫർ ബഫറിനൊപ്പം ഫിൽട്ടർ പേപ്പറിന് ഇടയിൽ ജെൽ ഇന്റർലേയർ കോമ്പിനേഷൻ സ്ഥാപിക്കുന്നു, കൂടാതെ ട്രാൻസ്ഫർ ഇഫക്റ്റ് നേടുന്നതിന് ഫിൽട്ടർ പേപ്പറിലെ ബഫർ അഡ്സോർബിലൂടെ കറന്റ് നടത്തുന്നു.നിലവിലെ ഫിലിം ഗ്ലൂവിൽ നേരിട്ട് പ്രവർത്തിക്കുന്നതിനാൽ, ട്രാൻസ്ഫർ വ്യവസ്ഥകൾ താരതമ്യേന കഠിനമാണ്, എന്നാൽ ട്രാൻസ്ഫർ സമയം ചെറുതാണ്, കാര്യക്ഷമത ഉയർന്നതാണ്.
(1) പരീക്ഷണാത്മക വ്യവസ്ഥകളുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്
കറന്റ് 1ma-2ma / cm2 ആണ്, ഞങ്ങൾ സാധാരണയായി 100mA / membrane ഉപയോഗിക്കുന്നു.ടാർഗെറ്റ് പ്രോട്ടീൻ തന്മാത്രയുടെ വലുപ്പവും ജെൽ സാന്ദ്രതയും അനുസരിച്ച് ട്രാൻസ്ഫർ സമയം തിരഞ്ഞെടുക്കാം, കൂടാതെ യഥാർത്ഥ സാഹചര്യത്തിനനുസരിച്ച് ഉചിതമായി ക്രമീകരിക്കാനും കഴിയും.
ടാർഗെറ്റ് പ്രോട്ടീൻ തന്മാത്രാ വലിപ്പം (kDa), ജെൽ സാന്ദ്രത, കൈമാറ്റ സമയം
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0.75
<20 15% 0.5
(2) പരീക്ഷണാത്മക പ്രവർത്തനം
(1) ഫിൽട്ടർ പേപ്പറും മെംബ്രണും തയ്യാറാക്കൽ (ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിന് 20 മിനിറ്റ് മുമ്പ് തയ്യാറാക്കൽ ആരംഭിക്കും).
എ. ഉടനടി തയ്യാറാക്കാത്ത, ആവശ്യത്തിന് ട്രാൻസ്ഫർ ബഫറുകൾ ഉണ്ടോയെന്ന് പരിശോധിക്കുക.
B. ഫിൽട്ടർ പേപ്പറും ശരിയായ വലിപ്പത്തിലുള്ള മെംബ്രണും ഉണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കുക.
C. ഏകദേശം 1-2 മിനിറ്റ് മെത്തനോളിൽ മെംബ്രൺ മുക്കുക.തുടർന്ന് ട്രാൻസ്ഫർ ബഫറിലേക്ക് മാറ്റി.
D. ട്രാൻസ്ഫർ ബഫറിൽ യഥാക്രമം അനുയോജ്യമായ പശ ഫിൽട്ടർ പേപ്പറും മെംബ്രൺ ഫിൽട്ടർ പേപ്പറും മുക്കിവയ്ക്കുക.
ട്രാൻസ്ഫർ ബഫറിൽ പ്രവേശിക്കുമ്പോൾ PDVF മെംബ്രൺ എത്രനേരം മെഥനോളിൽ മുക്കിവയ്ക്കണം?
പിവിഡിഎഫ് ഹൈഡ്രോഫോബിക് ആണ്, ട്രാൻസ്ഫർ ബഫറിൽ മുക്കിവയ്ക്കുന്നത് ബുദ്ധിമുട്ടാണ്.മെഥനോൾ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, കുതിർക്കാൻ എളുപ്പമാണ്.പിവിഡിഎഫിന്റെ മുൻകരുതൽ മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ച് കുതിർത്ത് സജീവമാക്കുക, തുടർന്ന് നന്നായി കുതിർത്ത ശേഷം വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ രണ്ടുതവണ കഴുകുക.മെഥനോൾ കുമിളകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിന്റെ ഉദ്ദേശ്യം പിവിഡിഎഫ് മെംബ്രണിൽ പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ള ഗ്രൂപ്പുകളെ സജീവമാക്കുകയും നെഗറ്റീവ് ചാർജുള്ള പ്രോട്ടീനുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് എളുപ്പമാക്കുകയും ചെയ്യുക എന്നതാണ്.
ആളുകൾ സാധാരണയായി ഇത് 5-20 മിനിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു.പശ എടുക്കുന്ന അതേ സമയം ഇത് നനയ്ക്കാം, ഇത് ഏകദേശം 5 മിനിറ്റ് എടുക്കുമെന്ന് കണക്കാക്കുന്നു.പ്രഭാവം മോശമല്ല.മുൻകാലങ്ങളിൽ, ചില വെബ്‌സുഹൃത്തുക്കൾ പ്രോസസ്സിംഗ് സമയം കാര്യമാക്കേണ്ടതില്ല, പക്ഷേ പ്രധാന കാര്യം സിനിമയുടെ ഗുണനിലവാരമാണ്.അത് ശരിയാണ്.മെംബ്രൺ പൂർണ്ണമായും നനഞ്ഞിരിക്കുന്നിടത്തോളം, അത് ശരിയായിരിക്കണം.
ഹൈബോണ്ടിന്റെ പിവിഡിഎഫ് സ്പെസിഫിക്കേഷൻ ഇപ്രകാരമാണ്: "100% മെറ്റനോൾ (10 സെക്കൻഡ്) ഉപയോഗിച്ച് മെംബ്രൺ മുൻകൂട്ടി നനയ്ക്കുക".കുറഞ്ഞത് 10 സെക്കൻഡ് കുതിർക്കുന്നത് ശരിയാണെന്നാണ് എന്റെ ധാരണ.വാസ്തവത്തിൽ, 10 സെക്കൻഡോ 10 മിനിറ്റോ മുക്കിവയ്ക്കുന്നത് ശരിയാണ്.
(2) കൈമാറ്റം
എ. ഇലക്ട്രിക് ട്രാൻസ്ഫർ ഇൻസ്ട്രുമെന്റിൽ താഴെയുള്ള ഫിൽട്ടർ പേപ്പർ ഇടുക.സാധാരണയായി മൂന്ന് പാളികളാണ് ഉപയോഗിക്കുന്നത്.
B. മെംബ്രേണിന് നേരെ ഫിൽട്ടർ പേപ്പറിൽ മെംബ്രൺ വയ്ക്കുക, മെംബ്രണിനും ഫിൽട്ടർ പേപ്പറിനും ഇടയിൽ കുമിളകൾ ഉണ്ടാകാതിരിക്കാൻ ശ്രദ്ധിക്കുക, കൂടാതെ മെംബ്രൺ നനയാതിരിക്കാൻ കുറച്ച് ട്രാൻസ്ഫർ ബഫർ മെംബ്രണിലേക്ക് ഒഴിക്കുക.
സി. ഗ്ലൂ ഓഫ് പീൽ, സ്റ്റാക്ക് ജെൽ നീക്കം ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം ഫിലിമിലേക്ക് നീക്കുക.
D. ഫിലിമിന്റെ മുകളിൽ ഇടത് കോണിൽ മുറിച്ച്, പെൻസിൽ ഉപയോഗിച്ച് ഫിലിമിലെ പശ സ്ഥാനം അടയാളപ്പെടുത്തുക.
E. പശയിലെ പശയ്‌ക്കെതിരെ ഒരു കഷണം ഫിൽട്ടർ പേപ്പർ മൂടുക.കുറച്ച് ട്രാൻസ്ഫർ ബഫർ ഒഴിച്ച് രണ്ട് ഫിൽട്ടർ പേപ്പർ ഇടുക.
എഫ്. ഇലക്ട്രിക് ട്രാൻസ്ഫർ ഇൻസ്‌ട്രുമെന്റ് ഇൻസ്റ്റാൾ ചെയ്ത് ആവശ്യത്തിനനുസരിച്ച് ആവശ്യമായ കറന്റും സമയവും തിരഞ്ഞെടുക്കുക.
G. ട്രാൻസ്ഫർ പ്രക്രിയയിൽ, വോൾട്ടേജ് മാറ്റം ഏത് സമയത്തും നിരീക്ഷിക്കപ്പെടും, കൂടാതെ ഏതെങ്കിലും അസാധാരണത്വം കൃത്യസമയത്ത് ക്രമീകരിക്കുകയും ചെയ്യും.
പോസ്റ്റ് സമയം: സെപ്റ്റംബർ-07-2022
