पृथक्करण गोंद कसे वापरावे?- भाग 1

पृथक्करण गोंद कसे वापरावे?

वेस्टर्न ब्लॉट मेम्ब्रेन ट्रान्सफर

करंटच्या कृती अंतर्गत, प्रथिने जेलमधून घन वाहक (झिल्ली) मध्ये हस्तांतरित केली जाते.

झिल्ली निवड: सामान्यपणे वापरल्या जाणार्‍या सॉलिड-फेज मटेरियलमध्ये NC मेम्ब्रेन, DBM, DDT, नायलॉन मेम्ब्रेन, PVDF इत्यादींचा समावेश होतो. आम्ही PVDF (पॉलिव्हिनिलीडिन फ्लोराईड) निवडतो, ज्यामध्ये प्रथिने शोषण, शारीरिक शक्ती आणि उत्तम रासायनिक सुसंगतता असते.दोन वैशिष्ट्ये आहेत: immobilon-p (0.45um) आणि immobilon PSQ (MW < 20kDa साठी 0.2um).

अर्ध कोरडी पद्धत

म्हणजेच, जेल इंटरलेअर कॉम्बिनेशन ट्रान्सफर बफरसह फिल्टर पेपर दरम्यान ठेवले जाते आणि ट्रान्सफर इफेक्ट साध्य करण्यासाठी फिल्टर पेपरवर शोषलेल्या बफरद्वारे विद्युत प्रवाह चालविला जातो.कारण वर्तमान थेट फिल्म ग्लूवर कार्य करते, हस्तांतरण परिस्थिती तुलनेने कठोर आहे, परंतु हस्तांतरण वेळ कमी आहे आणि कार्यक्षमता जास्त आहे.

(1) प्रायोगिक परिस्थितीची निवड

वर्तमान 1ma-2ma/cm2 आहे आणि आम्ही सहसा 100mA/झिल्ली वापरतो.हस्तांतरण वेळ लक्ष्य प्रोटीन रेणूच्या आकारानुसार आणि जेलच्या एकाग्रतेनुसार निवडला जाऊ शकतो आणि वास्तविक परिस्थितीनुसार योग्यरित्या समायोजित केला जाऊ शकतो.

लक्ष्य प्रोटीन आण्विक आकार (kDa), जेल एकाग्रता आणि हस्तांतरण वेळ

80---140 8% 1.5-2.0

२५---८० १०% १.५

१५—४० १२% ०.७५

<20 15% 0.5

(2) प्रायोगिक ऑपरेशन

(1) फिल्टर पेपर आणि मेम्ब्रेन तयार करणे (तयारी इलेक्ट्रोफोरेसीसच्या 20 मिनिटे आधी सुरू करावी).

A. पुरेसे हस्तांतरण बफर आहेत की नाही ते तपासा, जे लगेच तयार केलेले नाहीत.

B. फिल्टर पेपर आणि योग्य आकाराचा पडदा आहे का ते तपासा.

C. पडदा मिथेनॉलमध्ये 1-2 मिनिटे बुडवा.आणि नंतर हस्तांतरण बफर मध्ये हस्तांतरित.

D. ट्रान्सफर बफरमध्ये अनुक्रमे योग्य चिकट फिल्टर पेपर आणि मेम्ब्रेन फिल्टर पेपर भिजवा.

हस्तांतरण बफरमध्ये प्रवेश करताना PDVF पडदा मिथेनॉलमध्ये किती काळ भिजवावा?

PVDF हायड्रोफोबिक आहे, आणि ट्रान्सफर बफरमध्ये भिजवणे कठीण आहे.मिथेनॉल उपचारानंतर, ते भिजवणे सोपे आहे.PVDF ची प्रीट्रीटमेंट म्हणजे मिथेनॉलने भिजवणे आणि सक्रिय करणे आणि नंतर ते पूर्णपणे भिजल्यानंतर डिस्टिल्ड पाण्याने दोनदा धुवा.मिथेनॉल फुगे वापरण्याचा उद्देश PVDF झिल्लीवरील सकारात्मक चार्ज केलेले गट सक्रिय करणे आणि नकारात्मक चार्ज केलेल्या प्रथिने बांधणे सोपे करणे हा आहे.

लोक सहसा ते 5-20 मिनिटांसाठी वापरतात.गोंद घेताना त्याच वेळी ते भिजवता येते आणि त्याला सुमारे 5 मिनिटे लागतील असा अंदाज आहे.परिणाम वाईट नाही.पूर्वी, काही वेबमित्रांनी पोस्ट केले होते की प्रक्रियेच्या वेळेत फारसा फरक पडत नाही, परंतु मुख्य गोष्ट म्हणजे चित्रपटाची गुणवत्ता.ते खरे आहे.जोपर्यंत पडदा पूर्णपणे भिजलेला आहे तोपर्यंत ते ठीक असले पाहिजे.

Hybond चे PVDF स्पेसिफिकेशन खालील प्रमाणे वाचते: "100% मेटॅनॉल (10 सेकंद) मध्ये पडदा ओला करा".माझी समज अशी आहे की किमान 10 सेकंद भिजणे ठीक आहे.खरं तर, 10 सेकंद किंवा 10 मिनिटे भिजवणे ठीक आहे.

(2) हस्तांतरण

A. इलेक्ट्रिक ट्रान्सफर इन्स्ट्रुमेंटवर खालचा फिल्टर पेपर ठेवा.साधारणपणे तीन थर वापरले जातात.

B. फिल्टर पेपरवर पडदा पडद्याच्या विरुद्ध ठेवा, पडदा आणि फिल्टर पेपर यांच्यामध्ये बुडबुडे नसावेत याकडे लक्ष द्या आणि पडदा ओला ठेवण्यासाठी काही ट्रान्सफर बफर झिल्लीवर घाला.

C. गोंद सोलून घ्या, स्टॅक जेल काढा आणि काळजीपूर्वक फिल्मवर हलवा.

D. चित्रपटाचा वरचा डावा कोपरा कापून टाका आणि पेन्सिलने चित्रपटावरील गोंद स्थान चिन्हांकित करा.

E. गोंद वर गोंद विरुद्ध फिल्टर पेपर एक तुकडा झाकून.काही ट्रान्सफर बफर घाला आणि फिल्टर पेपरचे दोन तुकडे घाला.

F. इलेक्ट्रिक ट्रान्सफर इन्स्ट्रुमेंट स्थापित करा आणि गरजेनुसार आवश्यक वर्तमान आणि वेळ निवडा.

G. हस्तांतरण प्रक्रियेदरम्यान, व्होल्टेज बदल कोणत्याही वेळी साजरा केला जाईल, आणि कोणत्याही असामान्यता वेळेत समायोजित केली जाईल.