Bagaimana cara menggunakan lem pemisah?- Bagian 1

Bagaimana cara menggunakan lem pemisah?

Transfer membran western blot

Di bawah aksi arus, protein dipindahkan dari gel ke pembawa padat (membran).

Pemilihan membran: bahan fase padat yang umum digunakan dalam pencetakan termasuk membran NC, DBM, DDT, membran nilon, PVDF, dll. Kami memilih PVDF (polivinilidena fluorida), yang memiliki adsorpsi protein yang lebih baik, kekuatan fisik, dan kompatibilitas kimia yang lebih baik.Ada dua spesifikasi: immobilon-p (0,45um) dan immobilon PSQ (0,2um untuk MW <20kDa).

Metode setengah kering

Artinya, kombinasi interlayer gel ditempatkan di antara kertas saring dengan buffer transfer, dan arus dialirkan melalui buffer yang teradsorpsi pada kertas saring untuk mencapai efek transfer.Karena arus bekerja langsung pada lem film, kondisi transfernya relatif keras, tetapi waktu transfernya pendek dan efisiensinya tinggi.

(1) pemilihan kondisi percobaan

Saat ini adalah 1ma-2ma / cm2, dan kami biasanya menggunakan 100mA / membran.Waktu transfer dapat dipilih sesuai dengan ukuran molekul protein target dan konsentrasi gel, dan dapat disesuaikan dengan tepat sesuai dengan situasi sebenarnya.

Ukuran molekul protein target (kDa), konsentrasi gel dan waktu transfer

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operasi eksperimental

(1) Persiapan kertas saring dan membran (persiapan harus dimulai 20 menit sebelum elektroforesis).

J. Periksa apakah terdapat cukup buffer transfer, yang tidak segera disiapkan.

B. Periksa apakah ada kertas saring dan membran dengan ukuran yang sesuai.

C. Celupkan membran dalam methanol sekitar 1-2 menit.Dan kemudian ditransfer ke buffer transfer.

D. Rendam kertas saring berperekat yang sesuai dan kertas saring membran masing-masing ke dalam buffer transfer.

Berapa lama membran PDVF harus direndam dalam metanol saat memasuki buffer transfer?

PVDF bersifat hidrofobik, dan sulit untuk direndam dalam buffer transfer.Setelah perawatan metanol, lebih mudah direndam.Pretreatment PVDF adalah merendam dan mengaktifkannya dengan metanol, lalu mencucinya dua kali dengan air suling setelah direndam secara menyeluruh.Tujuan penggunaan gelembung metanol adalah untuk mengaktifkan gugus bermuatan positif pada membran PVDF dan memudahkan untuk berikatan dengan protein bermuatan negatif.

Orang biasanya menggunakannya selama 5-20 menit.Dapat direndam bersamaan dengan pengambilan lem, dan diperkirakan membutuhkan waktu sekitar 5 menit.Efeknya tidak buruk.Dulu, beberapa webfriend memposting bahwa waktu pemrosesan tidak terlalu penting, tetapi kuncinya adalah kualitas filmnya.Itu benar.Selama membran benar-benar basah, itu akan baik-baik saja.

Spesifikasi PVDF Hybond berbunyi sebagai berikut: "pra-basahi membran dalam 100% metanol (10 detik)".Pemahaman saya adalah tidak apa-apa untuk berendam setidaknya selama 10 detik.Faktanya, tidak apa-apa untuk berendam selama 10 detik atau 10 menit.

(2) Pemindahan

A. Letakkan kertas saring bagian bawah pada instrumen transfer elektrik.Umumnya tiga lapisan digunakan.

B. Letakkan membran pada kertas saring menempel pada membran, perhatikan agar tidak ada gelembung antara membran dan kertas saring, dan tuangkan sedikit buffer transfer ke membran agar membran tetap basah.

C. Kelupas lem, keluarkan tumpukan gel dan pindahkan dengan hati-hati ke film.

D. Potong sudut kiri atas film dan tandai posisi lem pada film dengan pensil.

E. Tutupi selembar kertas saring dengan lem pada lem.Tuang beberapa buffer transfer dan taruh dua lembar kertas saring.

F. Pasang instrumen transfer listrik dan pilih arus dan waktu yang diperlukan sesuai dengan kebutuhan.

G. Selama proses transfer, perubahan voltase harus diamati setiap saat, dan setiap ketidaknormalan harus disesuaikan pada waktunya.