Làm thế nào để sử dụng keo tách?
Chuyển màng Western blot
Dưới tác dụng của dòng điện, protein được chuyển từ gel sang chất mang rắn (màng).
Lựa chọn màng: các vật liệu pha rắn thường được sử dụng trong in ấn bao gồm màng NC, DBM, DDT, màng nylon, PVDF, v.v. Chúng tôi chọn PVDF (polyvinylidene fluoride), có khả năng hấp phụ protein tốt hơn, độ bền vật lý và khả năng tương thích hóa học tốt hơn.Có hai thông số kỹ thuật: cố định-p (0,45um) và cố định PSQ (0,2um cho MW < 20kDa).
Phương pháp bán khô
Đó là, sự kết hợp giữa các lớp gel được đặt giữa giấy lọc với bộ đệm chuyển và dòng điện được dẫn qua bộ đệm được hấp phụ trên giấy lọc để đạt được hiệu ứng chuyển.Do dòng điện tác dụng trực tiếp lên màng keo nên điều kiện truyền tương đối khắc nghiệt nhưng thời gian truyền ngắn, hiệu quả cao.
(1) lựa chọn điều kiện thí nghiệm
Dòng điện là 1ma-2ma/cm2, và chúng ta thường sử dụng 100mA/màng.Thời gian truyền có thể được chọn theo kích thước của phân tử protein mục tiêu và nồng độ gel, và có thể được điều chỉnh phù hợp theo tình hình thực tế.
Kích thước phân tử protein mục tiêu (kDa), nồng độ gel và thời gian truyền
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1,5
15—40 12% 0,75
<20 15% 0,5
(2) hoạt động thử nghiệm
(1) Chuẩn bị giấy lọc và màng (bắt đầu chuẩn bị 20 phút trước khi điện di).
A. Kiểm tra xem có đủ bộ đệm truyền không, không được chuẩn bị ngay lập tức.
B. Kiểm tra xem giấy lọc và màng có kích thước phù hợp hay không.
C. Ngâm màng trong metanol khoảng 1-2 phút.Và sau đó được chuyển đến bộ đệm chuyển.
D. Ngâm giấy lọc dính và giấy lọc màng tương ứng vào dung dịch đệm chuyển.
Màng PDVF nên ngâm trong metanol bao lâu khi vào dung dịch đệm chuyển?
PVDF kỵ nước và rất khó ngâm trong bộ đệm chuyển.Sau khi xử lý bằng metanol, nó dễ ngâm hơn.Quá trình tiền xử lý của PVDF là ngâm và kích hoạt nó bằng metanol, sau đó rửa hai lần bằng nước cất sau khi ngâm kỹ.Mục đích của việc sử dụng bong bóng metanol là kích hoạt các nhóm tích điện dương trên màng PVDF và giúp liên kết với các protein tích điện âm dễ dàng hơn.
Mọi người thường sử dụng nó trong 5-20 phút.Có thể ngâm keo cùng lúc với lấy keo, ước tính sẽ mất khoảng 5 phút.Hiệu quả không tệ.Trước đây một số bạn web có đăng rằng thời gian xử lý không quan trọng lắm mà quan trọng là chất lượng phim.Đúng.Miễn là màng được ngâm hoàn toàn, nó sẽ ổn.
Thông số kỹ thuật PVDF của Hybond có nội dung như sau: "làm ướt trước màng trong 100% metanol (10 giây)".Tôi hiểu rằng bạn có thể ngâm ít nhất 10 giây.Trên thực tế, bạn có thể ngâm trong 10 giây hoặc 10 phút.
(2) Chuyển nhượng
A. Đặt giấy lọc phía dưới lên thiết bị truyền điện.Nói chung ba lớp được sử dụng.
B. Đặt màng lên giấy lọc áp sát vào màng, chú ý không để có bong bóng giữa màng và giấy lọc, đổ một ít dung dịch đệm chuyển lên màng để giữ ẩm cho màng.
C. Bóc lớp keo, loại bỏ lớp gel ngăn xếp và cẩn thận di chuyển nó lên phim.
D. Cắt góc trên bên trái của phim và dùng bút chì đánh dấu vị trí keo trên phim.
E. Phủ một mảnh giấy lọc chống lại vết keo trên.Đổ một ít dung dịch đệm và đặt hai mảnh giấy lọc.
F. Cài đặt dụng cụ chuyển điện và chọn dòng điện và thời gian cần thiết theo nhu cầu.
G. Trong quá trình chuyển giao, phải quan sát thấy sự thay đổi điện áp bất cứ lúc nào và bất kỳ sự bất thường nào cũng phải được điều chỉnh kịp thời.
Thời gian đăng: Sep-07-2022
