Hogyan kell használni az elválasztó ragasztót?- 1. rész

Hogyan kell használni az elválasztó ragasztót?

Western blot membrántranszfer

Az áram hatására a fehérje a gélből a szilárd hordozóra (membránra) kerül.

Membrán kiválasztása: a leggyakrabban használt szilárd fázisú anyagok az imprintingben: NC membrán, DBM, DDT, nylon membrán, PVDF stb. A PVDF-et (polivinilidén-fluoridot) választjuk, amely jobb fehérjeadszorpcióval, fizikai szilárdsággal és kémiai kompatibilitással rendelkezik.Két specifikáció létezik: immobilon-p (0,45 um) és immobilon PSQ (0,2 um MW < 20 kDa esetén).

Félszáraz módszer

Ez azt jelenti, hogy a gél közbenső réteg kombinációt a szűrőpapír közé helyezik az átvivő pufferrel, és az áramot a szűrőpapíron adszorbeált pufferen vezetik át az átviteli hatás elérése érdekében.Mivel az áram közvetlenül a fóliaragasztóra hat, az átviteli feltételek viszonylag kemények, de az átviteli idő rövid és a hatásfok magas.

(1) a kísérleti körülmények kiválasztása

Az áramerősség 1ma-2ma/cm2, és általában 100mA/membránt használunk.Az átviteli idő a célfehérje molekula méretének és a gélkoncentrációnak megfelelően választható meg, és az aktuális helyzetnek megfelelően állítható be.

Célfehérje molekulaméret (kDa), gélkoncentráció és transzfer idő

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) kísérleti művelet

(1) Szűrőpapír és membrán előkészítése (az előkészítést az elektroforézis előtt 20 perccel kell elkezdeni).

V. Ellenőrizze, hogy van-e elegendő átviteli puffer, amely nem készül azonnal.

B. Ellenőrizze, hogy van-e megfelelő méretű szűrőpapír és membrán.

C. Merítse a membránt metanolba körülbelül 1-2 percre.Aztán átkerült az átviteli pufferbe.

D. Áztassa a megfelelő tapadó szűrőpapírt és membránszűrőpapírt a transzfer pufferbe.

Mennyi ideig kell a PDVF membránnak metanolban áznia, amikor belép a transzfer pufferbe?

A PVDF hidrofób, és nehezen áztatható be a transzfer pufferbe.Metanolos kezelés után könnyebben áztatható.A PVDF előkezelése metanollal történő áztatás és aktiválás, majd alapos áztatás után kétszer desztillált vízzel mossuk.A metanol buborékok használatának célja a PVDF membrán pozitív töltésű csoportjainak aktiválása és a negatív töltésű fehérjékhez való kötődés megkönnyítése.

Az emberek általában 5-20 percig használják.A ragasztó felvételével egyidőben beáztatható, és a becslések szerint körülbelül 5 percet vesz igénybe.A hatás nem rossz.A múltban néhány webbarát azt írta, hogy a feldolgozási idő nem sokat számít, de a kulcs a film minősége volt.Ez igaz.Amíg a membrán teljesen átázott, rendben kell lennie.

A Hybond PVDF specifikációja a következő: "előnedvesítse a membránt 100%-os metanolban (10 másodperc)".Úgy tudom, hogy rendben van, ha legalább 10 másodpercig áztatja.Valójában rendben van, ha 10 másodpercig vagy 10 percig áztatja.

(2) Átadás

A. Fektesse az alsó szűrőpapírt az elektromos átviteli műszerre.Általában három réteget használnak.

B. Fektesse a membránt a szűrőpapírra a membránhoz, ügyeljen arra, hogy ne legyenek buborékok a membrán és a szűrőpapír között, és öntsön egy kis transzfer puffert a membránra, hogy a membrán nedves maradjon.

C. Húzza le a ragasztót, távolítsa el a köteggélt, és óvatosan vigye rá a fóliára.

D. Vágja le a fólia bal felső sarkát, és ceruzával jelölje be a ragasztás helyét a filmen.

E. Takarjon le egy darab szűrőpapírt a ragasztón lévő ragasztóval szemben.Öntsön egy kis transzfer puffert, és helyezzen rá két darab szűrőpapírt.

F. Szerelje be az elektromos átviteli műszert, és válassza ki a szükséges áramot és időt az igényeknek megfelelően.

G. Az átviteli folyamat során a feszültségváltozást bármikor megfigyelni kell, és minden rendellenességet időben korrigálni kell.