Kepiye cara nggunakake lem pamisah?- bagean 1

Kepiye cara nggunakake lem pamisah?

Transfer membran blot barat

Ing tumindak saiki, protein ditransfer saka gel menyang operator padhet (membran).

Pilihan membran: bahan fase padat sing umum digunakake ing imprinting kalebu membran NC, DBM, DDT, membran nilon, PVDF, lan liya-liyane. Kita milih PVDF (polyvinylidene fluoride), sing nduweni adsorpsi protein sing luwih apik, kekuatan fisik lan kompatibilitas kimia sing luwih apik.Ana rong spesifikasi: immobilon-p (0.45um) lan immobilon PSQ (0.2um kanggo MW <20kDa).

Metode semi garing

Sing, kombinasi gel interlayer diselehake antarane kertas Filter karo buffer transfer, lan saiki wis conducted liwat buffer adsorbed ing kertas Filter kanggo entuk efek transfer.Amarga saiki tumindak langsung ing lim film, kahanan transfer relatif atos, nanging wektu transfer cendhak lan efficiency dhuwur.

(1) pilihan kahanan eksperimen

Saiki 1ma-2ma / cm2, lan biasane nggunakake 100mA / membran.Wektu transfer bisa dipilih miturut ukuran molekul protein target lan konsentrasi gel, lan bisa diatur kanthi tepat miturut kahanan sing nyata.

Ukuran molekul protein target (kDa), konsentrasi gel lan wektu transfer

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operasi eksperimen

(1) Preparation saka kertas Filter lan membran (preparation kudu diwiwiti 20 menit sadurunge elektroforesis).

A. Priksa manawa ana cukup buffer transfer, sing ora disiapake langsung.

B. Priksa manawa ana kertas panyaring lan membran kanthi ukuran sing tepat.

C. Kacemplungaken membran ing metanol kanggo bab 1-2 menit.Lan banjur ditransfer menyang buffer transfer.

D. Rendhem kertas Filter adhesive cocok lan kertas Filter membran menyang buffer transfer mungguh.

Suwene membran PDVF kudu direndhem ing metanol nalika mlebu buffer transfer?

PVDF hidrofobik, lan angel rendhem ing buffer transfer.Sawise perawatan metanol, luwih gampang direndhem.Pretreatment PVDF yaiku rendhem lan aktifake nganggo metanol, banjur dicuci kaping pindho nganggo banyu suling sawise direndhem kanthi sak tenane.Tujuan nggunakake gelembung metanol yaiku kanggo ngaktifake gugus sing diisi positif ing membran PVDF lan nggampangake ikatan karo protein sing duwe muatan negatif.

Wong biasane nggunakake kanggo 5-20 menit.Bisa direndhem bebarengan karo njupuk lem, lan kira-kira bakal njupuk bab 5 menit.Efek ora ala.Ing jaman biyen, sawetara kanca web ngirim manawa wektu pangolahan ora penting, nanging sing penting yaiku kualitas film kasebut.Sing bener.Anggere membran rampung direndhem, iku kudu OK.

Spesifikasi PVDF Hybond maca kaya ing ngisor iki: "pra wet membran ing 100% metanol (10 detik)".Pangertosan kula punika OK kanggo rendhem kanggo paling 10 detik.Nyatane, oke kanggo rendhem kanggo 10 detik utawa 10 menit.

(2) Transfer

A. Lay kertas Filter ngisor ing instrument transfer listrik.Umume telung lapisan digunakake.

B. Lay membran ing kertas Filter marang membran, mbayar manungsa waé kanggo ora umpluk antarane membran lan kertas Filter, lan pour sawetara buffer transfer dhateng membran kanggo njaga membran udan.

C. Copot lem, copot gel tumpukan lan kanthi teliti pindhah menyang film.

D. Cut pojok kiwa ndhuwur film lan tandhani posisi lim ing film kanthi potlot.

E. Nutupi selembar kertas panyaring marang lem ing lim.Tuang sawetara buffer transfer lan lay rong bagéyan kertas Filter.

F. Instal instrumen transfer listrik lan pilih saiki lan wektu sing dibutuhake miturut kabutuhan.

G. Sajrone proses transfer, owah-owahan voltase bakal diamati ing sembarang wektu, lan sembarang abnormality bakal diatur ing wektu.