વિભાજન ગુંદરનો ઉપયોગ કેવી રીતે કરવો?
વેસ્ટર્ન બ્લોટ મેમ્બ્રેન ટ્રાન્સફર
વર્તમાનની ક્રિયા હેઠળ, પ્રોટીન જેલમાંથી ઘન વાહક (પટલ) માં સ્થાનાંતરિત થાય છે.
પટલની પસંદગી: છાપકામમાં સામાન્ય રીતે વપરાતી ઘન-તબક્કાની સામગ્રીમાં NC મેમ્બ્રેન, DBM, DDT, નાયલોન પટલ, PVDF વગેરેનો સમાવેશ થાય છે. અમે PVDF (પોલીવિનાઇલિડેન ફ્લોરાઇડ) પસંદ કરીએ છીએ, જેમાં પ્રોટીન શોષણ, શારીરિક શક્તિ અને બહેતર રાસાયણિક સુસંગતતા હોય છે.ત્યાં બે સ્પષ્ટીકરણો છે: immobilon-p (0.45um) અને immobilon PSQ (MW <20kDa માટે 0.2um).
અર્ધ સૂકી પદ્ધતિ
એટલે કે, ટ્રાન્સફર બફર સાથે ફિલ્ટર પેપરની વચ્ચે જેલ ઇન્ટરલેયર કોમ્બિનેશન મૂકવામાં આવે છે, અને ટ્રાન્સફર ઇફેક્ટ હાંસલ કરવા માટે ફિલ્ટર પેપર પર શોષાયેલા બફર દ્વારા વર્તમાનનું સંચાલન કરવામાં આવે છે.કારણ કે વર્તમાન ફિલ્મ ગુંદર પર સીધું કાર્ય કરે છે, ટ્રાન્સફર શરતો પ્રમાણમાં કઠોર છે, પરંતુ ટ્રાન્સફર સમય ઓછો છે અને કાર્યક્ષમતા વધારે છે.
(1) પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓની પસંદગી
વર્તમાન 1ma-2ma/cm2 છે, અને અમે સામાન્ય રીતે 100mA/મેમ્બ્રેનનો ઉપયોગ કરીએ છીએ.સ્થાનાંતરણ સમય લક્ષ્ય પ્રોટીન પરમાણુના કદ અને જેલ સાંદ્રતા અનુસાર પસંદ કરી શકાય છે, અને વાસ્તવિક પરિસ્થિતિ અનુસાર યોગ્ય રીતે ગોઠવી શકાય છે.
લક્ષ્ય પ્રોટીન પરમાણુ કદ (kDa), જેલ સાંદ્રતા અને ટ્રાન્સફર સમય
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0.75
<20 15% 0.5
(2) પ્રાયોગિક કામગીરી
(1) ફિલ્ટર પેપર અને મેમ્બ્રેનની તૈયારી (તૈયારી ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસની 20 મિનિટ પહેલા શરૂ કરવી જોઈએ).
A. તપાસો કે શું ત્યાં પર્યાપ્ત ટ્રાન્સફર બફર્સ છે, જે તરત જ તૈયાર નથી.
B. યોગ્ય કદના ફિલ્ટર પેપર અને મેમ્બ્રેન છે કે કેમ તે તપાસો.
C. પટલને મિથેનોલમાં લગભગ 1-2 મિનિટ માટે બોળી દો.અને પછી ટ્રાન્સફર બફર પર સ્થાનાંતરિત.
D. ટ્રાન્સફર બફરમાં અનુક્રમે યોગ્ય એડહેસિવ ફિલ્ટર પેપર અને મેમ્બ્રેન ફિલ્ટર પેપરને પલાળી રાખો.
ટ્રાન્સફર બફર દાખલ કરતી વખતે PDVF પટલને મિથેનોલમાં કેટલો સમય પલાળી રાખવો જોઈએ?
PVDF હાઇડ્રોફોબિક છે, અને ટ્રાન્સફર બફરમાં તેને ભીંજવી મુશ્કેલ છે.મિથેનોલની સારવાર પછી, તેને પલાળવું સરળ છે.PVDF ની પ્રીટ્રીટમેન્ટ એ છે કે તેને મિથેનોલથી પલાળીને સક્રિય કરો અને પછી તેને સારી રીતે પલાળ્યા પછી નિસ્યંદિત પાણીથી બે વાર ધોઈ લો.મિથેનોલ પરપોટાનો ઉપયોગ કરવાનો હેતુ PVDF પટલ પર હકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલા જૂથોને સક્રિય કરવાનો છે અને તેને નકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરેલ પ્રોટીન સાથે બાંધવાનું સરળ બનાવે છે.
લોકો સામાન્ય રીતે તેનો ઉપયોગ 5-20 મિનિટ માટે કરે છે.તે ગુંદર લેવાના સમયે જ પલાળી શકાય છે, અને અંદાજ છે કે તે લગભગ 5 મિનિટ લેશે.અસર ખરાબ નથી.ભૂતકાળમાં, કેટલાક વેબફ્રેન્ડ્સે પોસ્ટ કર્યું હતું કે પ્રક્રિયાના સમયમાં બહુ ફરક પડતો નથી, પરંતુ મુખ્ય વસ્તુ ફિલ્મની ગુણવત્તા હતી.તે સાચું છે.જ્યાં સુધી પટલ સંપૂર્ણપણે પલાળેલી હોય ત્યાં સુધી તે બરાબર હોવું જોઈએ.
હાઇબોન્ડનું PVDF સ્પષ્ટીકરણ નીચે પ્રમાણે વાંચે છે: "100% મેટાનોલ (10 સેકન્ડ)માં પટલને પહેલાથી ભીની કરો".મારી સમજણ એ છે કે ઓછામાં ઓછા 10 સેકન્ડ માટે પલાળવું બરાબર છે.હકીકતમાં, 10 સેકન્ડ અથવા 10 મિનિટ માટે પલાળવું બરાબર છે.
(2) ટ્રાન્સફર
A. ઇલેક્ટ્રિક ટ્રાન્સફર ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ પર નીચલું ફિલ્ટર પેપર મૂકો.સામાન્ય રીતે ત્રણ સ્તરોનો ઉપયોગ થાય છે.
B. પટલને ફિલ્ટર પેપર પર પટલની સામે મૂકો, પટલ અને ફિલ્ટર પેપર વચ્ચે પરપોટા ન હોવા પર ધ્યાન આપો, અને પટલને ભીનું રાખવા માટે પટલ પર થોડો ટ્રાન્સફર બફર રેડો.
C. ગુંદરની છાલ ઉતારો, સ્ટેક જેલને દૂર કરો અને કાળજીપૂર્વક તેને ફિલ્મ પર ખસેડો.
D. ફિલ્મના ઉપરના ડાબા ખૂણાને કાપી નાખો અને પેન્સિલ વડે ફિલ્મ પર ગુંદરની સ્થિતિને ચિહ્નિત કરો.
E. ગુંદર પર ગુંદર સામે ફિલ્ટર પેપરનો ટુકડો ઢાંકવો.થોડું ટ્રાન્સફર બફર રેડો અને ફિલ્ટર પેપરના બે ટુકડા મૂકો.
F. ઇલેક્ટ્રિક ટ્રાન્સફર ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ ઇન્સ્ટોલ કરો અને જરૂરિયાતો અનુસાર જરૂરી વર્તમાન અને સમય પસંદ કરો.
G. ટ્રાન્સફર પ્રક્રિયા દરમિયાન, વોલ્ટેજ ફેરફાર કોઈપણ સમયે જોવામાં આવશે, અને કોઈપણ અસાધારણતાને સમયસર સમાયોજિત કરવામાં આવશે.
પોસ્ટનો સમય: સપ્ટે-07-2022
