Hoe kinne jo skiedingslym brûke?
Western blot membraan oerdracht
Under de aksje fan stroom wurdt it aaiwyt oerbrocht fan 'e gel nei de fêste drager (membraan).
Membraan seleksje: de meast brûkte bêst-fase materialen yn imprinting befetsje NC membraan, DBM, DDT, nylon membraan, PVDF, ensfh Wy kieze PVDF (polyvinylidene fluoride), dat hat bettere protein adsorption, fysike krêft en better gemyske komptabiliteit.D'r binne twa spesifikaasjes: immobilon-p (0.45um) en immobilon PSQ (0.2um foar MW <20kDa).
In semi-droege metoade
Dat is, de gel-interlayer-kombinaasje wurdt pleatst tusken it filterpapier mei de transferbuffer, en de aktuele wurdt útfierd troch de buffer adsorbearre op it filterpapier om it transfereffekt te berikken.Om't de aktuele direkt op 'e filmlym wurket, binne de oerdrachtbetingsten relatyf hurd, mar de oerdrachttiid is koart en de effisjinsje is heech.
(1) seleksje fan eksperimintele betingsten
De stroom is 1ma-2ma / cm2, en wy brûke normaal 100mA / membraan.De oerdrachttiid kin wurde selektearre neffens de grutte fan it doelproteinmolekule en de gelkonsintraasje, en kin passend oanpast wurde neffens de eigentlike situaasje.
Doelprotein molekulêre grutte (kDa), gel konsintraasje en oerdracht tiid
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0,75
<20 15% 0,5
(2) eksperimintele operaasje
(1) Tarieding fan filterpapier en membraan (tarieding sil begjinne 20 minuten foar elektroforese).
A. Kontrolearje oft der genôch oerdracht buffers, dy't net taret fuortendaliks.
B. Kontrolearje oft der filter papier en membraan fan goede grutte.
C. Dompelje it membraan yn methanol foar likernôch 1-2 minuten.En dan oerdroegen oan de oerdracht buffer.
D. Soak it passende adhesive filterpapier en membraanfilterpapier respektivelik yn 'e transferbuffer.
Hoe lang moat it PDVF-membraan yn methanol wekke by it ynfieren fan 'e transferbuffer?
PVDF is hydrophobic, en it is lestich om te weakjen yn de oerdracht buffer.Nei methanolbehanneling is it makliker te wekjen.De foarbehanneling fan PVDF is om it te waskjen en te aktivearjen mei methanol, en it dan twa kear te waskjen mei destillearre wetter nei't se yngeand weagje.It doel fan it brûken fan methanol bubbels is te aktivearjen de posityf opladen groepen op de PVDF membraan en meitsje it makliker te binen mei negatyf opladen aaiwiten.
Minsken brûke it normaal foar 5-20 minuten.It kin wurde socht tagelyk as it nimmen fan de lijm, en it wurdt rûsd dat it sil nimme oer 5 minuten.It effekt is net min.Yn it ferline berjochten guon webfreonen dat de ferwurkingstiid net folle útmakke, mar de kaai wie de kwaliteit fan de film.Dat is wier.Salang't it membraan folslein trochdrenkt is, moat it OK wêze.
Hybond's PVDF-spesifikaasje lêst as folget: "it membraan pre wiet yn 100% metanol (10 sekonden)".Myn begryp is dat it goed is om op syn minst 10 sekonden te waskjen.Yn feite is it OK om 10 sekonden of 10 minuten te wekjen.
(2) Oerdracht
A. Lege de legere filter papier op de elektryske oerdracht ynstrumint.Algemien wurde trije lagen brûkt.
B. Lege it membraan op it filterpapier tsjin it membraan, let op dat der gjin bubbels tusken it membraan en it filterpapier hawwe, en gie wat transferbuffer op it membraan om it membraan wiet te hâlden.
C. Skilje de lijm ôf, ferwiderje de stackgel en ferpleatse it foarsichtich op 'e film.
D. Snij de boppeste linker hoeke fan 'e film ôf en markearje de lijmposysje op' e film mei in potlead.
E. Cover in stikje filterpapier tsjin de lijm op 'e lijm.Giet wat transferbuffer en lei twa stikken filterpapier.
F. Ynstallearje it elektryske oerdrachtynstrumint en selektearje de fereaske stroom en tiid neffens de behoeften.
G. Tidens it oerdrachtproses sil de spanningsferoaring op elk momint beoardiele wurde, en elke abnormaliteit sil yn 'e tiid oanpast wurde.
Post tiid: Sep-07-2022
