Тусгаарлагч цавууг хэрхэн хэрэглэх вэ?- 1-р хэсэг

Тусгаарлагч цавууг хэрхэн хэрэглэх вэ?

Western blot мембран дамжуулалт

Гүйдлийн үйл ажиллагааны дор уураг нь гельээс хатуу зөөгч (мембран) руу шилждэг.

Мембран сонгох: хэвлэхдээ түгээмэл хэрэглэгддэг хатуу фазын материалд NC мембран, DBM, DDT, нейлон мембран, PVDF гэх мэт орно. Бид PVDF (поливинилиден фтор) -ийг сонгодог бөгөөд энэ нь уургийн шингээлт, физик хүч чадал, химийн нийцэмж сайтай.Хоёр үзүүлэлт байдаг: immobilon-p (0.45um) болон immobilon PSQ (MW < 20kDa-д 0.2um).

Хагас хуурай арга

Өөрөөр хэлбэл, гель хоорондын давхаргын хослолыг дамжуулагч буфер бүхий шүүлтүүр цаасны хооронд байрлуулж, дамжуулалтын үр дүнд хүрэхийн тулд шүүлтүүрийн цаасан дээр шингэсэн буферээр гүйдэл явуулдаг.Гүйдэл нь хальсны цавуу дээр шууд үйлчилдэг тул дамжуулах нөхцөл нь харьцангуй хатуу боловч дамжуулах хугацаа богино, үр ашиг өндөр байдаг.

(1) туршилтын нөхцөлийг сонгох

Гүйдэл нь 1ма-2ма / см2 бөгөөд бид ихэвчлэн 100мА / мембран ашигладаг.Дамжуулах хугацааг зорилтот уургийн молекулын хэмжээ болон гель концентрацийн дагуу сонгож, бодит нөхцөл байдалд тохируулан тохируулж болно.

Зорилтот уургийн молекулын хэмжээ (кДа), гель концентраци ба дамжуулах хугацаа

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) туршилтын ажиллагаа

(1) Шүүлтүүрийн цаас ба мембраныг бэлтгэх (бэлтгэх ажлыг электрофорез хийхээс 20 минутын өмнө эхлүүлнэ).

A. Шууд бэлтгэгдээгүй байгаа шилжүүлгийн буфер хангалттай байгаа эсэхийг шалгана уу.

B. Шүүлтүүрийн цаас, зохих хэмжээтэй мембран байгаа эсэхийг шалгана.

C. Метанолд мембраныг 1-2 минут орчим дүрнэ.Дараа нь шилжүүлгийн буфер руу шилжүүлнэ.

D. Тохирох наалдамхай шүүлтүүрийн цаас болон мембран шүүлтүүрийн цаасыг шилжүүлэх буферт тус тус нэвт норгоно.

Шилжүүлгийн буферт ороход PDVF мембран метанолд хэр удаан шингэх ёстой вэ?

PVDF нь гидрофобик бөгөөд дамжуулах буферт шингээхэд хэцүү байдаг.Метанол эмчилгээ хийсний дараа нэвт норгох нь илүү хялбар байдаг.PVDF-ийн урьдчилсан боловсруулалт нь метанолоор шингээж, идэвхжүүлж, сайтар дэвтээсний дараа нэрмэл усаар хоёр удаа угаана.Метанолын бөмбөлгийг ашиглах зорилго нь PVDF мембран дээрх эерэг цэнэгтэй бүлгүүдийг идэвхжүүлж, сөрөг цэнэгтэй уурагтай холбоход хялбар болгох явдал юм.

Хүмүүс ихэвчлэн 5-20 минутын турш хэрэглэдэг.Цавууг авахтай зэрэгцүүлэн дэвтээж болох бөгөөд 5 минут орчим болно гэж тооцоолж байна.Үр нөлөө нь муу биш юм.Урьд нь зарим вэб найзууд зураг авалтын хугацаа тийм ч чухал биш байсан ч гол зүйл нь киноны чанар байсан гэж бичдэг байсан.Энэ үнэн.Мембраныг бүрэн дэвтээсэн л бол зүгээр байх ёстой.

Hybond-ийн PVDF техникийн үзүүлэлтүүд нь "мембраныг 100% метанолд (10 секунд) урьдчилан норгох" гэж бичсэн байна.Миний ойлгож байгаагаар дор хаяж 10 секунд усанд дэвтээвэл зүгээр.Уг нь 10 секунд юм уу 10 минут дэвтээвэл зүгээр.

(2) шилжүүлэх

A. Доод шүүлтүүрийн цаасыг цахилгаан дамжуулах хэрэгсэл дээр тавина.Ерөнхийдөө гурван давхаргыг ашигладаг.

B. Шүүлтүүрийн цаасан дээр мембраныг нааж, мембран болон шүүлтүүрийн цаасны хооронд бөмбөлөг үүсгэхгүй байхыг анхаарч, мембраныг чийгтэй байлгахын тулд мембран дээр шилжүүлгийн буфер хийнэ.

C. Цавууг хуулж, стекийн гелийг аваад хальсан дээр болгоомжтой шилжүүлнэ.

D. Киноны зүүн дээд буланг хайчилж, хальсан дээрх цавууны байрлалыг харандаагаар тэмдэглэнэ.

E. Цавуу дээрх цавууны эсрэг шүүлтүүрийн цаасыг таглана.Дамжуулах буфер асгаж, хоёр ширхэг шүүлтүүр цаас тавина.

F. Цахилгаан дамжуулах хэрэгслийг суурилуулж, хэрэгцээнд нийцүүлэн шаардлагатай гүйдэл, цагийг сонгоно.

G. Дамжуулах явцад хүчдэлийн өөрчлөлтийг ямар ч үед ажиглаж, хэвийн бус байдлыг цаг тухайд нь тохируулна.