Como usar a cola de separação?- parte 1

Como usar a cola de separação?

Transferência de membrana Western blot

Sob a ação da corrente, a proteína é transferida do gel para o carreador sólido (membrana).

Seleção de membrana: os materiais de fase sólida comumente usados ​​na impressão incluem membrana NC, DBM, DDT, membrana de nylon, PVDF, etc. Escolhemos PVDF (fluoreto de polivinilideno), que tem melhor adsorção de proteínas, resistência física e melhor compatibilidade química.Existem duas especificações: immobilon-p (0,45um) e immobilon PSQ (0,2um para MW < 20kDa).

Um método semi-seco

Ou seja, a combinação da camada intermediária de gel é colocada entre o papel de filtro com o buffer de transferência e a corrente é conduzida através do buffer adsorvido no papel de filtro para obter o efeito de transferência.Como a corrente atua diretamente na cola do filme, as condições de transferência são relativamente duras, mas o tempo de transferência é curto e a eficiência é alta.

(1) seleção de condições experimentais

A corrente é 1ma-2ma/cm2, e costumamos usar 100mA/membrana.O tempo de transferência pode ser selecionado de acordo com o tamanho da molécula de proteína alvo e a concentração do gel, e pode ser ajustado adequadamente de acordo com a situação real.

Tamanho molecular da proteína alvo (kDa), concentração do gel e tempo de transferência

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operação experimental

(1) Preparação do papel de filtro e da membrana (a preparação deve ser iniciada 20 minutos antes da eletroforese).

A. Verifique se há buffers de transferência suficientes, que não são preparados imediatamente.

B. Verifique se há papel de filtro e membrana de tamanho adequado.

C. Mergulhe a membrana em metanol por cerca de 1-2 minutos.E então transferido para o buffer de transferência.

D. Mergulhe o papel de filtro adesivo apropriado e o papel de filtro de membrana no tampão de transferência, respectivamente.

Por quanto tempo a membrana PDVF deve ficar de molho em metanol ao entrar no tampão de transferência?

O PVDF é hidrofóbico e é difícil de absorver no tampão de transferência.Após o tratamento com metanol, é mais fácil de embeber.O pré-tratamento do PVDF é embebê-lo e ativá-lo com metanol e, em seguida, lavá-lo duas vezes com água destilada após a imersão completa.O objetivo do uso de bolhas de metanol é ativar os grupos carregados positivamente na membrana PVDF e facilitar a ligação com proteínas carregadas negativamente.

As pessoas costumam usá-lo por 5-20 minutos.Pode ser embebido ao mesmo tempo que se tira a cola, e estima-se que demore cerca de 5 minutos.O efeito não é ruim.No passado, alguns amigos da web postaram que o tempo de processamento não importava muito, mas a chave era a qualidade do filme.Isso é verdade.Desde que a membrana esteja completamente encharcada, tudo bem.

A especificação PVDF da Hybond diz o seguinte: "pré-molhar a membrana em metanol 100% (10 segundos)".Meu entendimento é que não há problema em mergulhar por pelo menos 10 segundos.Na verdade, não há problema em mergulhar por 10 segundos ou 10 minutos.

(2) Transferência

A. Coloque o papel de filtro inferior no instrumento de transferência elétrica.Geralmente três camadas são usadas.

B. Coloque a membrana no papel de filtro contra a membrana, preste atenção para não haver bolhas entre a membrana e o papel de filtro e despeje um pouco de tampão de transferência na membrana para mantê-la úmida.

C. Retire a cola, remova o gel de pilha e mova-o cuidadosamente para o filme.

D. Corte o canto superior esquerdo do filme e marque a posição da cola no filme com um lápis.

E. Cubra um pedaço de papel de filtro contra a cola na cola.Despeje um pouco de tampão de transferência e coloque dois pedaços de papel de filtro.

F. Instale o instrumento de transferência elétrica e selecione a corrente e o tempo necessários de acordo com as necessidades.

G. Durante o processo de transferência, a mudança de tensão deve ser observada a qualquer momento e qualquer anormalidade deve ser corrigida a tempo.