Hvordan bruger man separationslim?
Western blot membranoverførsel
Under påvirkning af strøm overføres proteinet fra gelen til den faste bærer (membran).
Membranvalg: De almindeligt anvendte fastfasematerialer til prægning omfatter NC-membran, DBM, DDT, nylonmembran, PVDF osv. Vi vælger PVDF (polyvinylidenfluorid), som har bedre proteinadsorption, fysisk styrke og bedre kemisk kompatibilitet.Der er to specifikationer: immobilon-p (0,45um) og immobilon PSQ (0,2um for MW < 20kDa).
En halvtør metode
Det vil sige, at gel-mellemlagskombinationen placeres mellem filterpapiret med overføringsbufferen, og strømmen ledes gennem bufferen adsorberet på filterpapiret for at opnå overføringseffekten.Fordi strømmen virker direkte på filmlimen, er overføringsbetingelserne relativt barske, men overføringstiden er kort og effektiviteten høj.
(1) udvælgelse af eksperimentelle betingelser
Strømmen er 1ma-2ma / cm2, og vi bruger normalt 100mA / membran.Overførselstiden kan vælges i henhold til målproteinmolekylets størrelse og gelkoncentrationen og kan justeres passende i henhold til den aktuelle situation.
Målproteinmolekylstørrelse (kDa), gelkoncentration og overførselstid
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1,5
15—40 12 % 0,75
<20 15 % 0,5
(2) eksperimentel drift
(1) Klargøring af filterpapir og membran (forberedelse skal påbegyndes 20 minutter før elektroforese).
A. Kontroller, om der er nok overførselsbuffere, som ikke er klargjort med det samme.
B. Tjek om der er filterpapir og membran af den rigtige størrelse.
C. Nedsænk membranen i methanol i ca. 1-2 minutter.Og derefter overført til overførselsbufferen.
D. Udblød det passende klæbende filterpapir og membranfilterpapir i henholdsvis overførselsbufferen.
Hvor længe skal PDVF-membranen suge i methanol, når den kommer ind i transferbufferen?
PVDF er hydrofobt, og det er svært at suge i overføringsbufferen.Efter methanolbehandling er det lettere at gennembløde.Forbehandlingen af PVDF er at gennembløde og aktivere den med methanol, og derefter vaske den to gange med destilleret vand efter grundig iblødsætning.Formålet med at bruge methanolbobler er at aktivere de positivt ladede grupper på PVDF-membranen og gøre det nemmere at binde med negativt ladede proteiner.
Folk bruger det normalt i 5-20 minutter.Det kan lægges i blød samtidig med at man tager limen, og det anslås, at det tager omkring 5 minutter.Effekten er ikke dårlig.Tidligere skrev nogle webvenner, at behandlingstiden ikke betød meget, men det vigtigste var filmens kvalitet.Det er rigtigt.Så længe membranen er helt gennemblødt, burde den være OK.
Hybonds PVDF-specifikation lyder som følger: "Forvand membranen i 100 % metanol (10 sekunder)".Min forståelse er, at det er OK at ligge i blød i mindst 10 sekunder.Faktisk er det OK at ligge i blød i 10 sekunder eller 10 minutter.
(2) Overførsel
A. Læg det nederste filterpapir på det elektriske overførselsinstrument.Generelt anvendes tre lag.
B. Læg membranen på filterpapiret mod membranen, vær opmærksom på ikke at have bobler mellem membranen og filterpapiret, og hæld noget transferbuffer på membranen for at holde membranen våd.
C. Pil limen af, fjern stablegelen og flyt den forsigtigt over på filmen.
D. Klip det øverste venstre hjørne af filmen af og marker limpositionen på filmen med en blyant.
E. Dæk et stykke filterpapir mod limen på limen.Hæld noget transferbuffer og læg to stykker filterpapir.
F. Installer det elektriske overførselsinstrument og vælg den nødvendige strøm og tid i overensstemmelse med behovene.
G. Under overførselsprocessen skal spændingsændringen observeres til enhver tid, og enhver unormalitet skal justeres i tide.
Indlægstid: Sep-07-2022
