Бөлгіш желімді қалай қолдануға болады?– 1 бөлім

Бөлгіш желімді қалай қолдануға болады?

Вестерн-блот мембраналық трансфер

Ток әсерінен белок гельден қатты тасымалдаушыға (мембранаға) ауысады.

Мембрананы таңдау: басып шығаруда жиі қолданылатын қатты фазалық материалдарға NC мембранасы, DBM, DDT, нейлон мембранасы, PVDF және т.б. жатады. Біз ақуызды жақсырақ сіңіру, физикалық күш және жақсы химиялық үйлесімділік бар PVDF (поливинилиден фториді) таңдаймыз.Екі спецификация бар: immobilon-p (0,45um) және immobilon PSQ (MW < 20kDa үшін 0,2um).

Жартылай құрғақ әдіс

Яғни, тасымалдау буфері бар сүзгі қағазының арасына гель аралық қабаттың комбинациясы қойылады, ал сүзгі қағазында адсорбцияланған буфер арқылы ток өткізгіш әсерге жету үшін өткізіледі.Ток пленка желіміне тікелей әсер ететіндіктен, тасымалдау шарттары салыстырмалы түрде қатал, бірақ тасымалдау уақыты қысқа және тиімділігі жоғары.

(1) эксперимент шарттарын таңдау

Ток күші 1ма-2ма / см2, және біз әдетте 100мА / мембрананы пайдаланамыз.Тасымалдау уақытын мақсатты ақуыз молекуласының өлшеміне және гель концентрациясына сәйкес таңдауға болады және нақты жағдайға сәйкес тиісті түрде реттеуге болады.

Мақсатты ақуыз молекулалық мөлшері (кДа), гель концентрациясы және тасымалдау уақыты

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) эксперименттік операция

(1) Сүзгі қағазы мен мембрананы дайындау (дайындау электрофорезден 20 минут бұрын басталуы керек).

A. Жеткілікті тасымалдау буферлерінің бар-жоғын тексеріңіз, олар дереу дайындалмайды.

B. Сәйкес өлшемдегі сүзгі қағазы мен мембрананың бар-жоғын тексеріңіз.

C. Метанолға мембрананы шамамен 1-2 минутқа батырыңыз.Содан кейін тасымалдау буферіне ауыстырылады.

D. Тиісті жабысқақ сүзгі қағазын және мембраналық сүзгі қағазын тиісінше тасымалдау буферіне жібітіңіз.

Трансфер буферіне кірген кезде PDVF мембранасы метанолға қанша уақыт сіңірілуі керек?

PVDF гидрофобты болып табылады және оны тасымалдау буферіне сіңіру қиын.Метанолмен өңдеуден кейін оны сіңіру оңайырақ.PVDF алдын ала өңдеу оны метанолмен жібіту және белсендіру, содан кейін мұқият жібіткеннен кейін тазартылған сумен екі рет жуу болып табылады.Метанол көпіршіктерін пайдаланудың мақсаты PVDF мембранасындағы оң зарядталған топтарды белсендіру және теріс зарядталған ақуыздармен байланысуды жеңілдету болып табылады.

Адамдар оны әдетте 5-20 минут пайдаланады.Оны желімді алумен бір мезгілде сіңдіруге болады және шамамен 5 минут кетеді деп есептеледі.Әсері жаман емес.Бұрын кейбір веб-достар өңдеу уақыты маңызды емес екенін, бірақ бастысы фильмнің сапасы екенін жазған.Бұл рас.Мембрана толығымен суланғанша, ол жақсы болуы керек.

Hybond PVDF спецификациясы келесідей оқылады: «мембрананы 100% метанолда (10 секунд) алдын ала сулаңыз».Менің түсінуімше, кем дегенде 10 секунд суға түсу дұрыс.Шындығында, 10 секунд немесе 10 минут бойы суға түсу дұрыс.

(2) Тасымалдау

A. Төменгі сүзгі қағазын электр тасымалдағышқа салыңыз.Әдетте үш қабат қолданылады.

B. Мембрананы сүзгі қағазының үстіне мембранаға қарсы қойыңыз, мембрана мен сүзгі қағазының арасында көпіршіктердің болмауына назар аударыңыз және мембрананы ылғалды ұстау үшін мембранаға біраз тасымалдау буферін құйыңыз.

C. Желімді аршып, десте гелін алып тастаңыз және оны пленкаға абайлап жылжытыңыз.

D. Пленканың жоғарғы сол жақ бұрышын кесіп, пленкадағы желім орнын қарындашпен белгілеңіз.

E. Желімдегі желімге қарсы сүзгі қағазын жабыңыз.Аздап тасымалдау буферін құйып, екі сүзгі қағазын салыңыз.

F. Электр тасымалдағышты орнатыңыз және қажеттіліктерге сәйкес қажетті ток пен уақытты таңдаңыз.

G. Тасымалдау процесі кезінде кернеудің өзгеруін кез келген уақытта байқау керек және кез келген ауытқу уақытында реттелуі керек.