Hoe om skeidingsgom te gebruik?
Western klad membraan oordrag
Onder die werking van stroom word die proteïen van die gel na die vaste draer (membraan) oorgedra.
Membraankeuse: die algemeen gebruikte vaste-fase-materiale in drukwerk sluit in NC-membraan, DBM, DDT, nylonmembraan, PVDF, ens. Ons kies PVDF (polivinielideenfluoried), wat beter proteïenadsorpsie, fisiese sterkte en beter chemiese verenigbaarheid het.Daar is twee spesifikasies: immobilon-p (0.45um) en immobilon PSQ (0.2um vir MW < 20kDa).
'n Semi-droë metode
Dit wil sê, die gel-tussenlaagkombinasie word tussen die filtreerpapier met die oordragbuffer geplaas, en die stroom word gelei deur die buffer wat op die filtreerpapier geadsorbeer is om die oordrageffek te verkry.Omdat die stroom direk op die filmgom inwerk, is die oordragtoestande relatief moeilik, maar die oordragtyd is kort en die doeltreffendheid is hoog.
(1) seleksie van eksperimentele toestande
Die stroom is 1ma-2ma / cm2, en ons gebruik gewoonlik 100mA / membraan.Die oordragtyd kan gekies word volgens die grootte van die teikenproteïenmolekule en die gelkonsentrasie, en kan toepaslik aangepas word volgens die werklike situasie.
Teiken proteïen molekulêre grootte (kDa), jel konsentrasie en oordrag tyd
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0,75
<20 15% 0,5
(2) eksperimentele werking
(1) Voorbereiding van filtreerpapier en membraan (voorbereiding moet 20 minute voor elektroforese begin word).
A. Kyk of daar genoeg oordragbuffers is, wat nie dadelik voorberei word nie.
B. Kyk of daar filtreerpapier en membraan van die regte grootte is.
C. Dompel die membraan in metanol vir ongeveer 1-2 minute.En dan oorgedra na die oordrag buffer.
D. Week die toepaslike kleeffiltreerpapier en membraanfiltreerpapier onderskeidelik in die oordragbuffer.
Hoe lank moet die PDVF-membraan in metanol week wanneer dit die oordragbuffer binnegaan?
PVDF is hidrofobies, en dit is moeilik om in die oordragbuffer te week.Na metanolbehandeling is dit makliker om te week.Die voorbehandeling van PVDF is om dit met metanol te week en te aktiveer, en dit dan twee keer met gedistilleerde water te was nadat dit deeglik geweek is.Die doel van die gebruik van metanolborrels is om die positief gelaaide groepe op die PVDF-membraan te aktiveer en dit makliker te maak om met negatief gelaaide proteïene te bind.
Mense gebruik dit gewoonlik vir 5-20 minute.Dit kan geweek word op dieselfde tyd as wat die gom geneem word, en daar word beraam dat dit ongeveer 5 minute sal neem.Die effek is nie sleg nie.In die verlede het sommige webvriende geplaas dat die verwerkingstyd nie veel saak maak nie, maar die sleutel was die kwaliteit van die film.Dis waar.Solank die membraan heeltemal geweek is, behoort dit in orde te wees.
Hybond se PVDF-spesifikasie lees soos volg: "voornat die membraan in 100% metanol (10 sekondes)".My begrip is dat dit goed is om vir ten minste 10 sekondes te week.Trouens, dit is reg om vir 10 sekondes of 10 minute te week.
(2) Oordrag
A. Lê die onderste filtreerpapier op die elektriese oordraginstrument.Oor die algemeen word drie lae gebruik.
B. Lê die membraan op die filtreerpapier teen die membraan, let op dat daar nie borrels tussen die membraan en die filtreerpapier is nie, en gooi 'n bietjie oordragbuffer op die membraan om die membraan nat te hou.
C. Trek die gom af, verwyder die stapelgel en skuif dit versigtig op die film.
D. Sny die boonste linkerhoek van die film af en merk die gomposisie op die film met 'n potlood.
E. Bedek 'n stuk filtreerpapier teen die gom op die gom.Gooi 'n bietjie oordragbuffer en lê twee stukke filtreerpapier.
F. Installeer die elektriese oordraginstrument en kies die vereiste stroom en tyd volgens die behoeftes.
G. Tydens die oordragproses sal die spanningsverandering te eniger tyd waargeneem word, en enige abnormaliteit sal betyds aangepas word.
Postyd: Sep-07-2022
