Jinsi ya kutumia gundi ya kujitenga?- sehemu 1

Jinsi ya kutumia gundi ya kujitenga?

Uhamisho wa utando wa mwaa wa Magharibi

Chini ya hatua ya sasa, protini huhamishwa kutoka kwa gel hadi kwa carrier imara (membrane).

Uteuzi wa utando: nyenzo za awamu gumu zinazotumiwa kwa kawaida katika uchapishaji ni pamoja na utando wa NC, DBM, DDT, utando wa nailoni, PVDF, n.k. Tunachagua PVDF (floridi ya polyvinylidene), ambayo ina utangazaji bora wa protini, nguvu za kimwili na utangamano bora wa kemikali.Kuna vipimo viwili: immobilon-p (0.45um) na immobilon PSQ (0.2um kwa MW <20kDa).

Njia ya nusu kavu

Hiyo ni, mchanganyiko wa interlayer ya gel huwekwa kati ya karatasi ya chujio na bafa ya uhamisho, na sasa inafanywa kwa njia ya bafa iliyotangazwa kwenye karatasi ya chujio ili kufikia athari ya uhamisho.Kwa sababu sasa vitendo vya moja kwa moja kwenye gundi ya filamu, hali ya uhamisho ni kiasi kikubwa, lakini muda wa uhamisho ni mfupi na ufanisi ni wa juu.

(1) uteuzi wa hali ya majaribio

Ya sasa ni 1ma-2ma / cm2, na kwa kawaida tunatumia 100mA / membrane.Muda wa uhamishaji unaweza kuchaguliwa kulingana na saizi ya molekuli ya protini inayolengwa na mkusanyiko wa gel, na inaweza kubadilishwa ipasavyo kulingana na hali halisi.

Lenga saizi ya molekuli ya protini (kDa), ukolezi wa gel na wakati wa kuhamisha

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15-40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) operesheni ya majaribio

(1) Maandalizi ya karatasi ya chujio na utando (maandalizi yataanzishwa dakika 20 kabla ya electrophoresis).

A. Angalia kama kuna vibafa vya kutosha vya uhamishaji, ambavyo havijatayarishwa mara moja.

B. Angalia kama kuna karatasi ya kichujio na utando wa ukubwa unaofaa.

C. Ingiza utando katika methanoli kwa takriban dakika 1-2.Na kisha kuhamishiwa kwa bafa ya uhamishaji.

D. Loweka karatasi inayofaa ya kichujio cha wambiso na karatasi ya chujio cha membrane kwenye bafa ya uhamishaji mtawalia.

Utando wa PDVF unapaswa kulowekwa kwenye methanoli kwa muda gani unapoingia kwenye bafa ya uhamishaji?

PVDF ina haidrofobu, na ni vigumu kuloweka kwenye bafa ya uhamishaji.Baada ya matibabu ya methanoli, ni rahisi kuloweka.Matayarisho ya PVDF ni kuloweka na kuiwasha na methanoli, na kisha kuosha mara mbili kwa maji yaliyosafishwa baada ya kulowekwa vizuri.Madhumuni ya kutumia viputo vya methanoli ni kuamilisha vikundi vilivyo na chaji chanya kwenye utando wa PVDF na kurahisisha kuunganisha na protini zenye chaji hasi.

Kawaida watu hutumia kwa dakika 5-20.Inaweza kulowekwa wakati huo huo na kuchukua gundi, na inakadiriwa kuwa itachukua kama dakika 5.Athari sio mbaya.Hapo awali, baadhi ya marafiki walichapisha kuwa muda wa usindikaji haujalishi sana, lakini jambo kuu lilikuwa ubora wa filamu.Hiyo ni kweli.Kwa muda mrefu kama membrane imejaa kabisa, inapaswa kuwa sawa.

Vipimo vya PVDF vya Hybond vinasomeka kama ifuatavyo: "kabla ya kulowesha utando kwa 100% metanol (sekunde 10)".Uelewa wangu ni kwamba ni sawa kuloweka kwa angalau sekunde 10.Kwa kweli, ni sawa kuloweka kwa sekunde 10 au dakika 10.

(2) Uhamisho

A. Weka karatasi ya chujio cha chini kwenye chombo cha uhamisho cha umeme.Kwa ujumla, tabaka tatu hutumiwa.

B. Weka utando kwenye karatasi ya chujio dhidi ya utando, zingatia usiwe na mapovu kati ya utando na karatasi ya kichujio, na mimina bafa ya uhamishaji kwenye utando ili kuweka utando unyevu.

C. Futa gundi, ondoa gel ya stack na uifanye kwa makini kwenye filamu.

D. Kata kona ya juu kushoto ya filamu na uweke alama ya gundi kwenye filamu na penseli.

E. Funika kipande cha karatasi ya chujio dhidi ya gundi kwenye gundi.Mimina bafa ya uhamishaji na weka vipande viwili vya karatasi ya kichungi.

F. Sakinisha chombo cha uhamisho wa umeme na uchague sasa na wakati unaohitajika kulingana na mahitaji.

G. Wakati wa mchakato wa uhamisho, mabadiliko ya voltage yatazingatiwa wakati wowote, na hali isiyo ya kawaida itarekebishwa kwa wakati.