Nola erabili bereizketa-kola?
Western blot mintzaren transferentzia
Korrontearen eraginez, proteina geletik eramaile solidora (mintza) igarotzen da.
Mintzaren hautaketa: inprimaketan fase solidoko materialen artean erabili ohi diren NC mintza, DBM, DDT, nylonezko mintza, PVDF, etab. PVDF (polivinilideno fluoruroa) aukeratzen dugu, proteina adsortzio hobea, indar fisikoa eta bateragarritasun kimiko hobea duena.Bi zehaztapen daude: immobilon-p (0,45um) eta immobilon PSQ (0,2um MW < 20kDa).
Metodo erdi lehorra
Hau da, gel-geruzaren arteko konbinazioa transferentzia-buffer-aren iragazki-paperaren artean jartzen da, eta korrontea iragazki-paperean xurgatutako buffer-aren bidez eramaten da transferentzia-efektua lortzeko.Korronteak filmaren kolan zuzenean eragiten duenez, transferentzia-baldintzak nahiko gogorrak dira, baina transferentzia denbora laburra da eta eraginkortasuna handia da.
(1) baldintza esperimentalen hautaketa
Korrontea 1ma-2ma / cm2 da, eta normalean 100mA / mintza erabiltzen dugu.Transferentzia-denbora xede-proteina molekularen tamainaren eta gel-kontzentrazioaren arabera hauta daiteke, eta egoki egokitu daiteke benetako egoeraren arabera.
Helburu-proteinaren tamaina molekularra (kDa), gel-kontzentrazioa eta transferentzia-denbora
80---140 %8 1,5-2,0
25---80 % 10 1,5
15—40 % 12 0,75
<20 % 15 0,5
(2) eragiketa esperimentala
(1) Iragazki-papera eta mintza prestatzea (elektroforesia baino 20 minutu lehenago hasi behar da prestaketa).
A. Egiaztatu transferentzia-buffer nahikoa dagoen, berehala prestatzen ez direnak.
B. Egiaztatu iragazki-papera eta tamaina egokiko mintza dagoen.
C. Sartu mintza metanolean 1-2 minutuz.Eta gero transferentzia bufferera transferitu.
D. Hartu iragazki-paper itsasgarri egokia eta mintz-iragazki-papera transferentzia-bufferean, hurrenez hurren.
Zenbat denbora behar du PDVF mintzak metanoletan busti transferentzia bufferera sartzean?
PVDF hidrofoboa da, eta zaila da transferentzia bufferean beratzea.Metanola tratatu ondoren, errazagoa da beratzen.PVDFren aurretratamendua metanolarekin bustitzea eta aktibatzea da, eta gero bi aldiz garbitu ur destilatuarekin ondo busti ondoren.Metanol-burbuilak erabiltzearen helburua PVDF mintzean karga positiboko taldeak aktibatzea eta negatiboki kargatutako proteinekin lotzea erraztea da.
Jendeak normalean 5-20 minutuz erabiltzen du.Kola hartzearekin batera busti daiteke, eta 5 minutu inguru beharko dituela kalkulatzen da.Efektua ez da txarra.Iraganean, weblagun batzuek argitaratu zuten prozesatzeko denborak ez zuela garrantzi handirik, baina gakoa filmaren kalitatea zen.Egia da.Mintza guztiz bustita dagoen bitartean, ondo egon beharko luke.
Hybond-en PVDF zehaztapenak honela dio: "pre busti mintza 100% metanol (10 segundo)".Nire ulermena da ondo dagoela gutxienez 10 segundoz beratzea.Izan ere, ondo dago 10 segundo edo 10 minutuz beratzea.
(2) Transferentzia
A. Jarri beheko iragazki-papera transferentzia elektrikoko tresnaren gainean.Orokorrean hiru geruza erabiltzen dira.
B. Jarri mintza iragazki-paperaren gainean mintzaren aurka, arreta jarri mintzaren eta iragazki-paperaren artean burbuilarik ez edukitzeko, eta isuri transferentzia-buffer bat mintzean, mintza bustita mantentzeko.
C. Kendu kola, kendu gel-pila eta arretaz eraman filmaren gainean.
D. Moztu filmaren goiko ezkerreko izkina eta markatu kola-posizioa arkatz batekin filmean.
E. Estali iragazki-paper bat kolaren kolaren aurka.Bota transferentzia-buffer pixka bat eta jarri iragazki-paper bi zati.
F. Instalatu transferentzia elektrikoko tresna eta hautatu behar den korrontea eta denbora beharren arabera.
G. Transferentzia prozesuan zehar, tentsio-aldaketa edozein unetan ikusi beharko da, eta edozein anomalia denboran egokituko da.
Argitalpenaren ordua: 2022-07-07
