Kaip naudoti atskyrimo klijus?
Western blot membranos perkėlimas
Veikiant srovei, baltymas perkeliamas iš gelio į kietą nešiklį (membraną).
Membranos pasirinkimas: dažniausiai naudojamos kietosios fazės medžiagos spausdinant: NC membrana, DBM, DDT, nailono membrana, PVDF ir kt. Mes pasirenkame PVDF (polivinilideno fluoridą), kuris pasižymi geresne baltymų adsorbcija, fiziniu stiprumu ir geresniu cheminiu suderinamumu.Yra dvi specifikacijos: immobilon-p (0,45 um) ir immobilon PSQ (0,2 um, kai MW < 20 kDa).
Pusiau sausas metodas
Tai yra, gelio tarpsluoksnių derinys dedamas tarp filtravimo popieriaus su pernešimo buferiu, o srovė yra praleidžiama per buferį, adsorbuotą ant filtravimo popieriaus, kad būtų pasiektas perdavimo efektas.Kadangi srovė tiesiogiai veikia plėvelės klijus, perdavimo sąlygos yra gana griežtos, tačiau perdavimo laikas trumpas, o efektyvumas didelis.
(1) eksperimento sąlygų parinkimas
Srovė yra 1ma-2ma / cm2, o mes paprastai naudojame 100 mA / membraną.Perkėlimo laikas gali būti parenkamas pagal tikslinės baltymo molekulės dydį ir gelio koncentraciją ir gali būti atitinkamai koreguojamas pagal faktinę situaciją.
Tikslinis baltymo molekulinis dydis (kDa), gelio koncentracija ir perdavimo laikas
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0,75
<20 15 % 0.5
(2) eksperimentinė operacija
(1) Filtravimo popieriaus ir membranos paruošimas (paruošimas pradedamas likus 20 minučių iki elektroforezės).
A. Patikrinkite, ar yra pakankamai perdavimo buferių, kurie paruošiami ne iš karto.
B. Patikrinkite, ar yra tinkamo dydžio filtravimo popieriaus ir membranos.
C. Panardinkite membraną į metanolį maždaug 1-2 minutėms.Ir tada perkelta į perdavimo buferį.
D. Sugerkite atitinkamą lipnų filtravimo popierių ir membraninį filtravimo popierių atitinkamai į perdavimo buferį.
Kiek laiko PDVF membrana turi mirkti metanolyje, kai patenka į perdavimo buferį?
PVDF yra hidrofobinis, todėl jį sunku įsiurbti pernešimo buferyje.Po apdorojimo metanoliu lengviau mirkyti.Išankstinis PVDF apdorojimas yra mirkyti ir aktyvuoti metanoliu, o po to du kartus nuplauti distiliuotu vandeniu po kruopštaus mirkymo.Metanolio burbuliukų naudojimo tikslas – aktyvuoti teigiamai įkrautas grupes ant PVDF membranos ir palengvinti prisijungimą prie neigiamo krūvio baltymų.
Žmonės paprastai naudojasi 5-20 minučių.Jį mirkyti galima tuo pačiu metu, kai imame klijus, o skaičiuojama, kad tai užtruks apie 5 minutes.Poveikis neblogas.Anksčiau kai kurie interneto draugai skelbė, kad apdorojimo laikas neturėjo didelės reikšmės, bet svarbiausia buvo filmo kokybė.Tai tiesa.Kol membrana yra visiškai įmirkusi, ji turėtų būti gerai.
„Hybond“ PVDF specifikacija skamba taip: „iš anksto sudrėkinkite membraną 100 % metanolyje (10 sekundžių)“.Aš suprantu, kad gerai mirkyti bent 10 sekundžių.Tiesą sakant, gerai mirkyti 10 sekundžių arba 10 minučių.
(2) Perdavimas
A. Ant elektrinio perdavimo instrumento uždėkite apatinį filtravimo popierių.Paprastai naudojami trys sluoksniai.
B. Padėkite membraną ant filtravimo popieriaus prie membranos, atkreipkite dėmesį, kad tarp membranos ir filtravimo popieriaus nebūtų burbuliukų, ir užpilkite šiek tiek pernešimo buferio ant membranos, kad membrana būtų drėgna.
C. Nulupkite klijus, nuimkite gelį ir atsargiai perkelkite ant plėvelės.
D. Nupjaukite viršutinį kairįjį plėvelės kampą ir pieštuku pažymėkite klijų padėtį ant plėvelės.
E. Uždenkite filtravimo popieriaus gabalėlį nuo klijų ant klijų.Įpilkite šiek tiek perdavimo buferio ir padėkite du filtravimo popieriaus gabalus.
F. Sumontuokite elektros perdavimo instrumentą ir pagal poreikius pasirinkite reikiamą srovę ir laiką.
G. Perkėlimo proceso metu bet kuriuo metu turi būti stebimas įtampos pokytis, o bet koks nukrypimas nuo normos turi būti laiku pakoreguotas.
Paskelbimo laikas: 2022-07-07
