Hur använder man separationslim?
Western blot-membranöverföring
Under inverkan av ström överförs proteinet från gelén till den fasta bäraren (membranet).
Membranval: de vanligaste fastfasmaterialen vid prägling inkluderar NC-membran, DBM, DDT, nylonmembran, PVDF, etc. Vi väljer PVDF (polyvinylidenfluorid), som har bättre proteinadsorption, fysisk styrka och bättre kemisk kompatibilitet.Det finns två specifikationer: immobilon-p (0,45um) och immobilon PSQ (0,2um för MW < 20kDa).
En halvtorr metod
Det vill säga, gel-mellanskiktskombinationen placeras mellan filterpapperet med överföringsbufferten, och strömmen leds genom bufferten som adsorberas på filterpapperet för att uppnå överföringseffekten.Eftersom strömmen verkar direkt på filmlimmet är överföringsförhållandena relativt hårda, men överföringstiden är kort och effektiviteten hög.
(1) urval av experimentella förhållanden
Strömmen är 1ma-2ma / cm2, och vi använder vanligtvis 100mA / membran.Överföringstiden kan väljas i enlighet med storleken på målproteinmolekylen och gelkoncentrationen, och kan justeras på lämpligt sätt enligt den faktiska situationen.
Målproteinmolekylstorlek (kDa), gelkoncentration och överföringstid
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1,5
15—40 12 % 0,75
<20 15 % 0,5
(2) experimentell drift
(1) Förberedelse av filterpapper och membran (förberedelse ska påbörjas 20 minuter före elektrofores).
A. Kontrollera om det finns tillräckligt med överföringsbuffertar som inte förbereds omedelbart.
B. Kontrollera om det finns filterpapper och membran av rätt storlek.
C. Sänk ned membranet i metanol i ca 1-2 minuter.Och sedan överförs till överföringsbufferten.
D. Blötlägg lämpligt självhäftande filterpapper respektive membranfilterpapper i överföringsbufferten.
Hur länge ska PDVF-membranet blötläggas i metanol när det går in i transferbufferten?
PVDF är hydrofobt och det är svårt att blötlägga i överföringsbufferten.Efter metanolbehandling är det lättare att blötlägga.Förbehandlingen av PVDF är att blötlägga och aktivera den med metanol och sedan tvätta den två gånger med destillerat vatten efter noggrann blötläggning.Syftet med att använda metanolbubblor är att aktivera de positivt laddade grupperna på PVDF-membranet och göra det lättare att binda med negativt laddade proteiner.
Folk använder det vanligtvis i 5-20 minuter.Det kan blötläggas samtidigt som man tar limet, och det beräknas ta cirka 5 minuter.Effekten är inte dålig.Tidigare skrev några webbvänner att behandlingstiden inte spelade så stor roll, men nyckeln var kvaliteten på filmen.Det är sant.Så länge membranet är helt genomblött bör det vara OK.
Hybonds PVDF-specifikation lyder som följer: "Förväta membranet i 100 % metanol (10 sekunder)".Jag förstår att det är OK att blötlägga i minst 10 sekunder.Faktum är att det är OK att blötlägga i 10 sekunder eller 10 minuter.
(2) Överföring
A. Lägg det nedre filterpapperet på det elektriska överföringsinstrumentet.I allmänhet används tre lager.
B. Lägg membranet på filterpapperet mot membranet, se till att det inte finns bubblor mellan membranet och filterpapperet och häll lite överföringsbuffert på membranet för att hålla membranet vått.
C. Dra av limmet, ta bort stapelgelen och flytta försiktigt över den på filmen.
D. Klipp av filmens övre vänstra hörn och markera limpositionen på filmen med en penna.
E. Täck en bit filterpapper mot limmet på limmet.Häll lite överföringsbuffert och lägg två bitar filterpapper.
F. Installera det elektriska överföringsinstrumentet och välj önskad ström och tid enligt behoven.
G. Under överföringsprocessen ska spänningsändringen observeras när som helst och eventuella avvikelser ska justeras i tid.
Posttid: 2022-07-07
