Cumu aduprà a cola di separazione?- parte 1

Cumu aduprà a cola di separazione?

Trasferimentu di a membrana Western blot

Sutta l'azzione di u currente, a proteina hè trasferita da u gel à u trasportatore solidu (membrana).

Selezzione di a membrana: i materiali di fase solida cumunimenti usati in l'imprinting includenu a membrana NC, DBM, DDT, membrana di nylon, PVDF, etc. Scegliemu PVDF (fluorur di polyvinylidene), chì hà megliu adsorption di prutezione, forza fisica è megliu cumpatibilità chimica.Ci sò duie specificazioni: immobilon-p (0.45um) è immobilon PSQ (0.2um per MW < 20kDa).

Un metudu semi seccu

Vale à dì, a combinazione di interlayer di gel hè piazzata trà u filtru di carta cù u buffer di trasferimentu, è u currente hè purtatu à traversu u buffer adsorbitu nantu à a carta di filtru per ottene l'effettu di trasferimentu.Perchè l'attuale attu direttamente nantu à a cola di film, e cundizioni di trasferimentu sò relativamente duru, ma u tempu di trasferimentu hè cortu è l'efficienza hè alta.

(1) selezzione di cundizioni spirimintali

U currente hè 1ma-2ma / cm2, è generalmente usemu 100mA / membrana.U tempu di trasferimentu pò esse sceltu secondu a dimensione di a molécula di proteina di destinazione è a cuncentrazione di gel, è pò esse adattatu in modu adattatu à a situazione attuale.

Dimensione moleculare di a proteina di destinazione (kDa), cuncentrazione di gel è tempu di trasferimentu

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15-40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operazione spirimintali

(1) Preparazione di carta di filtru è membrana (a preparazione deve esse cuminciata 20 minuti prima di l'elettroforesi).

A. Verificate s'ellu ci sò abbastanza buffers di trasferimentu, chì ùn sò micca preparati immediatamente.

B. Verificate s'ellu ci hè carta di filtru è membrana di taglia propria.

C. Immerse a membrana in metanolu per circa 1-2 minuti.E poi trasferitu à u buffer di trasferimentu.

D. Soak u carta di filtru adesivu appropritatu è a carta di filtru di membrana in u buffer di trasferimentu rispettivamente.

Quantu tempu a membrana PDVF deve esse immergeta in metanolu quandu entra in u buffer di trasferimentu?

PVDF hè idrofobu, è hè difficiule di immergerà in u buffer di trasferimentu.Dopu à u trattamentu di metanol, hè più faciule per immerge.U pretrattamentu di PVDF hè di immergellu è attivà cù metanol, è poi lavate duie volte cù acqua distillata dopu à sfondate bè.U scopu di l'usu di bolle di metanol hè di attivà i gruppi di carica positivamente nantu à a membrana PVDF è di fà più faciule per ligà cù proteine ​​​​carcate negativamente.

A ghjente di solitu aduprà per 5-20 minuti.Pò esse imbulighjate à u stessu tempu per piglià a cola, è hè stimatu chì duverà circa 5 minuti.L'effettu ùn hè micca male.In u passatu, certi webfriends anu publicatu chì u tempu di trasfurmazioni ùn importa micca assai, ma a chjave era a qualità di a film.Hè vera.Sempre chì a membrana hè sanu sanu, deve esse bè.

A specificazione PVDF d'Hybond si leghje cusì: "pre wet the membrane in 100% metanol (10 seconds)".A mo capiscitura hè chì hè bè di immergerà per almenu 10 seconde.In fatti, hè bè di immergerà per 10 seconde o 10 minuti.

(2) Trasferimentu

A. Pone a carta di filtru più bassu nantu à u strumentu di trasferimentu elettricu.In generale, trè strati sò usati.

B. Pone a membrana nantu à a carta di filtru contr'à a membrana, fate attenzione à ùn avè micca bolle trà a membrana è a carta di filtru, è pour qualchì buffer di trasferimentu nantu à a membrana per mantene a membrana bagnata.

C. Sbuchjate a cola, sguassate u gelu di stack è cun cura cun cura nantu à a film.

D. Cut off the top left corner of the film è marcate a pusizione di cola nantu à a film cun un lapis.

E. Coperta un pezzu di carta di filtru contr'à a cola nantu à a cola.Pour un pocu di buffer di trasferimentu è mette dui pezzi di carta di filtru.

F. Installa u strumentu di trasferimentu elettricu è selezziunate u currente è u tempu necessariu secondu i bisogni.

G. Durante u prucessu di trasferimentu, u cambiamentu di tensione deve esse osservatu in ogni mumentu, è ogni anormalità deve esse aghjustatu in u tempu.