Come usare la colla di separazione?- parte 1

Come usare la colla di separazione?

Trasferimento di membrana Western blot

Sotto l'azione della corrente, la proteina viene trasferita dal gel al supporto solido (membrana).

Selezione della membrana: i materiali in fase solida comunemente usati nell'imprinting includono membrana NC, DBM, DDT, membrana di nylon, PVDF, ecc. Scegliamo PVDF (polivinilidene fluoruro), che ha un migliore assorbimento proteico, resistenza fisica e migliore compatibilità chimica.Ci sono due specifiche: immobilon-p (0.45um) e immobilon PSQ (0.2um per MW < 20kDa).

Un metodo semi secco

Cioè, la combinazione di interstrato di gel viene posta tra la carta da filtro con il tampone di trasferimento e la corrente viene condotta attraverso il tampone adsorbito sulla carta da filtro per ottenere l'effetto di trasferimento.Poiché la corrente agisce direttamente sulla colla del film, le condizioni di trasferimento sono relativamente dure, ma il tempo di trasferimento è breve e l'efficienza è elevata.

(1) selezione delle condizioni sperimentali

La corrente è 1ma-2ma / cm2 e di solito usiamo 100mA / membrana.Il tempo di trasferimento può essere selezionato in base alle dimensioni della molecola proteica bersaglio e alla concentrazione del gel e può essere regolato in modo appropriato in base alla situazione effettiva.

Dimensione molecolare della proteina target (kDa), concentrazione del gel e tempo di trasferimento

80 --- 140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operazione sperimentale

(1) Preparazione della carta da filtro e della membrana (la preparazione deve iniziare 20 minuti prima dell'elettroforesi).

A. Controllare se ci sono abbastanza buffer di trasferimento, che non vengono preparati immediatamente.

B. Controllare se ci sono carta da filtro e membrana di dimensioni adeguate.

C. Immergere la membrana in metanolo per circa 1-2 minuti.E poi trasferito al buffer di trasferimento.

D. Immergere rispettivamente la carta da filtro adesiva e la carta da filtro a membrana appropriate nel tampone di trasferimento.

Per quanto tempo la membrana PDVF deve rimanere immersa nel metanolo quando entra nel tampone di trasferimento?

Il PVDF è idrofobo ed è difficile immergerlo nel tampone di trasferimento.Dopo il trattamento con metanolo, è più facile immergere.Il pretrattamento del PVDF consiste nell'imbeverlo e attivarlo con metanolo, quindi lavarlo due volte con acqua distillata dopo averlo immerso completamente.Lo scopo dell'utilizzo di bolle di metanolo è quello di attivare i gruppi caricati positivamente sulla membrana PVDF e facilitare il legame con le proteine ​​caricate negativamente.

Le persone di solito lo usano per 5-20 minuti.Può essere immerso nello stesso momento in cui si prende la colla e si stima che ci vorranno circa 5 minuti.L'effetto non è male.In passato, alcuni amici del web hanno postato che il tempo di elaborazione non contava molto, ma la chiave era la qualità del film.È vero.Finché la membrana è completamente bagnata, dovrebbe essere a posto.

La specifica PVDF di Hybond recita come segue: "pre-bagnare la membrana in 100% metanolo (10 secondi)".La mia comprensione è che va bene immergersi per almeno 10 secondi.In effetti, va bene immergere per 10 secondi o 10 minuti.

(2) Trasferimento

A. Appoggiare la carta da filtro inferiore sullo strumento di trasferimento elettrico.Generalmente vengono utilizzati tre strati.

B. Appoggiare la membrana sulla carta da filtro contro la membrana, facendo attenzione a non creare bolle tra la membrana e la carta da filtro, e versare del tampone di trasferimento sulla membrana per mantenere la membrana bagnata.

C. Staccare la colla, rimuovere la pila di gel e spostarla con cura sulla pellicola.

D. Tagliare l'angolo in alto a sinistra della pellicola e segnare con una matita la posizione della colla sulla pellicola.

E. Coprire un pezzo di carta da filtro contro la colla sulla colla.Versare del tampone di trasferimento e stendere due pezzi di carta da filtro.

F. Installare lo strumento di trasferimento elettrico e selezionare la corrente e il tempo richiesti in base alle esigenze.

G. Durante il processo di trasferimento, la variazione di tensione deve essere osservata in qualsiasi momento e qualsiasi anomalia deve essere regolata in tempo.