Wie verwende ich Trennkleber?- Teil 1

Wie verwende ich Trennkleber?

Western-Blot-Membrantransfer

Unter Stromeinwirkung wird das Protein vom Gel auf den festen Träger (Membran) übertragen.

Membranauswahl: Zu den beim Drucken häufig verwendeten Festphasenmaterialien gehören NC-Membran, DBM, DDT, Nylonmembran, PVDF usw. Wir wählen PVDF (Polyvinylidenfluorid), das eine bessere Proteinadsorption, physikalische Festigkeit und eine bessere chemische Verträglichkeit aufweist.Es gibt zwei Spezifikationen: Immobilon-p (0,45 µm) und Immobilon PSQ (0,2 µm für MW < 20 kDa).

Eine halbtrockene Methode

Das heißt, die Gel-Zwischenschichtkombination wird zwischen dem Filterpapier mit dem Transferpuffer platziert und der Strom wird durch den am Filterpapier adsorbierten Puffer geleitet, um den Transfereffekt zu erzielen.Da der Strom direkt auf den Folienkleber einwirkt, sind die Übertragungsbedingungen relativ rau, aber die Übertragungszeit ist kurz und die Effizienz hoch.

(1) Auswahl der Versuchsbedingungen

Der Strom beträgt 1ma-2ma/cm2, und wir verwenden normalerweise 100mA/Membran.Die Transferzeit kann entsprechend der Größe des Zielproteinmoleküls und der Gelkonzentration ausgewählt und entsprechend der tatsächlichen Situation angepasst werden.

Molekülgröße des Zielproteins (kDa), Gelkonzentration und Transferzeit

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10 % 1,5

15–40 12 % 0,75

<20 15 % 0,5

(2) experimenteller Betrieb

(1) Vorbereitung von Filterpapier und Membran (die Vorbereitung muss 20 Minuten vor der Elektrophorese beginnen).

A. Prüfen Sie, ob genügend Transferpuffer vorhanden sind, die nicht sofort vorbereitet werden.

B. Überprüfen Sie, ob Filterpapier und Membran in der richtigen Größe vorhanden sind.

C. Tauchen Sie die Membran etwa 1–2 Minuten lang in Methanol ein.Und dann in den Transferpuffer übertragen.

D. Das entsprechende Klebefilterpapier bzw. Membranfilterpapier in den Transferpuffer einweichen.

Wie lange sollte die PDVF-Membran beim Eintritt in den Transferpuffer in Methanol einweichen?

PVDF ist hydrophob und lässt sich nur schwer in den Transferpuffer einweichen.Nach der Methanolbehandlung lässt es sich leichter einweichen.Die Vorbehandlung von PVDF besteht darin, es mit Methanol einzuweichen und zu aktivieren und es nach gründlichem Einweichen zweimal mit destilliertem Wasser zu waschen.Der Zweck der Verwendung von Methanolblasen besteht darin, die positiv geladenen Gruppen auf der PVDF-Membran zu aktivieren und die Bindung an negativ geladene Proteine ​​zu erleichtern.

Normalerweise wird es 5–20 Minuten lang verwendet.Es kann gleichzeitig mit dem Auftragen des Klebers eingeweicht werden und dauert schätzungsweise etwa 5 Minuten.Der Effekt ist nicht schlecht.In der Vergangenheit haben einige Webfreunde gepostet, dass die Bearbeitungszeit keine große Rolle spielt, der Schlüssel aber die Qualität des Films sei.Das ist richtig.Solange die Membran vollständig durchnässt ist, sollte es in Ordnung sein.

Die PVDF-Spezifikation von Hybond lautet wie folgt: „Die Membran in 100 % Metanol vorbefeuchten (10 Sekunden)“.Nach meinem Verständnis ist es in Ordnung, es mindestens 10 Sekunden lang einzuweichen.Tatsächlich ist es in Ordnung, es 10 Sekunden oder 10 Minuten lang einzuweichen.

(2) Übertragung

A. Legen Sie das untere Filterpapier auf das elektrische Übertragungsinstrument.Im Allgemeinen werden drei Schichten verwendet.

B. Legen Sie die Membran auf das Filterpapier, achten Sie darauf, dass keine Blasen zwischen Membran und Filterpapier entstehen, und gießen Sie etwas Transferpuffer auf die Membran, um die Membran feucht zu halten.

C. Ziehen Sie den Kleber ab, entfernen Sie das Stapelgel und bewegen Sie es vorsichtig auf die Folie.

D. Schneiden Sie die obere linke Ecke der Folie ab und markieren Sie die Klebeposition auf der Folie mit einem Bleistift.

E. Decken Sie ein Stück Filterpapier gegen den Kleber auf dem Kleber ab.Gießen Sie etwas Transferpuffer hinein und legen Sie zwei Stücke Filterpapier darauf.

F. Installieren Sie das elektrische Übertragungsinstrument und wählen Sie je nach Bedarf den erforderlichen Strom und die erforderliche Zeit aus.

G. Während des Übertragungsvorgangs muss die Spannungsänderung jederzeit beobachtet und etwaige Abweichungen rechtzeitig korrigiert werden.