Comment utiliser la colle de séparation ?- partie 1

Comment utiliser la colle de séparation ?

Transfert de membrane Western blot

Sous l'action du courant, la protéine est transférée du gel vers le support solide (membrane).

Sélection de la membrane : les matériaux en phase solide couramment utilisés dans l'impression comprennent la membrane NC, le DBM, le DDT, la membrane en nylon, le PVDF, etc. Nous choisissons le PVDF (fluorure de polyvinylidène), qui a une meilleure adsorption des protéines, une meilleure résistance physique et une meilleure compatibilité chimique.Il existe deux spécifications : immobilon-p (0,45 µm) et immobilon PSQ (0,2 µm pour MW < 20 kDa).

Une méthode semi-sèche

C'est-à-dire que la combinaison intercouche de gel est placée entre le papier filtre avec le tampon de transfert, et le courant est conduit à travers le tampon adsorbé sur le papier filtre pour obtenir l'effet de transfert.Du fait que le courant agit directement sur la colle du film, les conditions de transfert sont relativement dures, mais le temps de transfert est court et le rendement est élevé.

(1) sélection des conditions expérimentales

Le courant est de 1ma-2ma/cm2, et nous utilisons généralement 100mA/membrane.Le temps de transfert peut être sélectionné en fonction de la taille de la molécule de protéine cible et de la concentration du gel, et peut être ajusté de manière appropriée en fonction de la situation réelle.

Taille moléculaire de la protéine cible (kDa), concentration du gel et temps de transfert

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1,5

15—40 12 % 0,75

<20 15% 0,5

(2) opération expérimentale

(1) Préparation du papier filtre et de la membrane (la préparation doit commencer 20 minutes avant l'électrophorèse).

A. Vérifiez s'il y a suffisamment de tampons de transfert, qui ne sont pas préparés immédiatement.

B. Vérifiez s'il y a du papier filtre et une membrane de taille appropriée.

C. Immerger la membrane dans du méthanol pendant environ 1 à 2 minutes.Et ensuite transféré dans le tampon de transfert.

D. Faire tremper respectivement le papier filtre adhésif et le papier filtre à membrane appropriés dans le tampon de transfert.

Combien de temps la membrane PDVF doit-elle tremper dans le méthanol lors de son entrée dans le tampon de transfert ?

Le PVDF est hydrophobe et il est difficile à tremper dans le tampon de transfert.Après traitement au méthanol, il est plus facile à tremper.Le prétraitement du PVDF consiste à le tremper et à l'activer avec du méthanol, puis à le laver deux fois avec de l'eau distillée après un trempage abondant.Le but de l'utilisation de bulles de méthanol est d'activer les groupes chargés positivement sur la membrane PVDF et de faciliter la liaison avec des protéines chargées négativement.

Les gens l'utilisent généralement pendant 5 à 20 minutes.Il peut être trempé en même temps que la colle, et on estime que cela prendra environ 5 minutes.L'effet est pas mal.Dans le passé, certains amis du web ont déclaré que le temps de traitement n'avait pas beaucoup d'importance, mais que la clé était la qualité du film.C'est vrai.Tant que la membrane est complètement imbibée, ça devrait aller.

La spécification PVDF de Hybond se lit comme suit : "pré-humidifier la membrane dans du méthanol à 100 % (10 secondes)".Ma compréhension est qu'il est acceptable de tremper pendant au moins 10 secondes.En fait, il est acceptable de tremper pendant 10 secondes ou 10 minutes.

(2) Transfert

A. Poser le papier filtre inférieur sur l'instrument de transfert électrique.Généralement trois couches sont utilisées.

B. Poser la membrane sur le papier filtre contre la membrane, faire attention à ne pas avoir de bulles entre la membrane et le papier filtre, et verser un peu de tampon de transfert sur la membrane pour garder la membrane humide.

C. Décollez la colle, retirez le gel de pile et déplacez-le délicatement sur le film.

D. Coupez le coin supérieur gauche du film et marquez la position de la colle sur le film avec un crayon.

E. Couvrir un morceau de papier filtre contre la colle sur la colle.Versez un peu de tampon de transfert et posez deux morceaux de papier filtre.

F. Installez l'instrument de transfert électrique et sélectionnez le courant et le temps requis en fonction des besoins.

G. Pendant le processus de transfert, le changement de tension doit être observé à tout moment et toute anomalie doit être ajustée à temps.