Kuinka käyttää erotusliimaa?- osa 1

Kuinka käyttää erotusliimaa?

Western blot -kalvonsiirto

Virran vaikutuksesta proteiini siirtyy geelistä kiinteälle kantajalle (kalvolle).

Kalvovalinta: painatuksessa yleisesti käytettyjä kiinteän faasin materiaaleja ovat NC-kalvo, DBM, DDT, nailonkalvo, PVDF jne. Valitsemme PVDF:n (polyvinylideenifluoridi), jolla on parempi proteiiniadsorptio, fysikaalinen lujuus ja parempi kemiallinen yhteensopivuus.Spesifikaatioita on kaksi: immobilon-p (0,45 um) ja immobilon PSQ (0,2 um MW < 20 kDa).

Puolikuiva menetelmä

Toisin sanoen geelivälikerrosyhdistelmä asetetaan siirtopuskurilla varustetun suodatinpaperin väliin ja virta johdetaan suodatinpaperille adsorboidun puskurin läpi siirtovaikutuksen saavuttamiseksi.Koska virta vaikuttaa suoraan kalvoliimaan, siirtoolosuhteet ovat suhteellisen ankarat, mutta siirtoaika on lyhyt ja hyötysuhde korkea.

(1) koeolosuhteiden valinta

Virta on 1ma-2ma / cm2, ja käytämme yleensä 100mA / kalvo.Siirtoaika voidaan valita kohdeproteiinimolekyylin koon ja geelipitoisuuden mukaan, ja sitä voidaan säätää sopivasti todellisen tilanteen mukaan.

Tavoiteproteiinin molekyylikoko (kDa), geelipitoisuus ja siirtoaika

80---140 8 % 1,5-2,0

25---80 10 % 1.5

15—40 12 % 0,75

<20 15 % 0.5

(2) kokeellinen toiminta

(1) Suodatinpaperin ja kalvon valmistelu (valmistus on aloitettava 20 minuuttia ennen elektroforeesia).

A. Tarkista, onko tarpeeksi siirtopuskureita, joita ei valmisteta heti.

B. Tarkista, onko suodatinpaperia ja kalvoa oikean kokoisia.

C. Upota kalvo metanoliin noin 1-2 minuutiksi.Ja sitten siirretään siirtopuskuriin.

D. Liota sopiva liimasuodatinpaperi ja kalvosuodatinpaperi siirtopuskuriin.

Kuinka kauan PDVF-kalvon tulee imeytyä metanolissa, kun se menee siirtopuskuriin?

PVDF on hydrofobinen, ja sitä on vaikea imeytyä siirtopuskuriin.Metanolikäsittelyn jälkeen se on helpompi liottaa.PVDF:n esikäsittely on liottaa ja aktivoida se metanolilla ja pestä se sitten kahdesti tislatulla vedellä perusteellisen liotuksen jälkeen.Metanolikuplien käytön tarkoituksena on aktivoida PVDF-kalvon positiivisesti varautuneita ryhmiä ja helpottaa sitoutumista negatiivisesti varautuneisiin proteiineihin.

Ihmiset käyttävät sitä yleensä 5-20 minuuttia.Se voidaan liottaa samanaikaisesti liiman ottamisen kanssa, ja sen arvioidaan kestävän noin 5 minuuttia.Vaikutus ei ole huono.Aiemmin jotkut verkkoystävät sanoivat, että käsittelyajalla ei ollut paljon väliä, mutta avain oli elokuvan laatu.Se on totta.Niin kauan kuin kalvo on täysin kastunut, sen pitäisi olla kunnossa.

Hybondin PVDF-spesifikaatiossa lukee seuraavaa: "esikostuta kalvo 100 % metanolissa (10 sekuntia)".Ymmärtääkseni on OK liottaa vähintään 10 sekuntia.Itse asiassa on OK liottaa 10 sekuntia tai 10 minuuttia.

(2) Siirto

A. Aseta alempi suodatinpaperi sähköisen siirtolaitteen päälle.Yleensä käytetään kolmea kerrosta.

B. Aseta kalvo suodatinpaperille kalvoa vasten, varo, ettei kalvon ja suodatinpaperin väliin jää kuplia, ja kaada kalvolle hieman siirtopuskuria pitääksesi kalvon kosteana.

C. Irrota liima, poista pinogeeli ja siirrä se varovasti kalvolle.

D. Leikkaa kalvon vasen yläkulma irti ja merkitse lyijykynällä liimakohta kalvoon.

E. Peitä pala suodatinpaperia liiman päällä olevaa liimaa vasten.Kaada hieman siirtopuskuria ja aseta kaksi palaa suodatinpaperia.

F. Asenna sähköinen siirtolaite ja valitse tarvittava virta ja aika tarpeiden mukaan.

G. Siirtoprosessin aikana jännitteen muutosta on tarkkailtava milloin tahansa, ja kaikki poikkeavuudet on korjattava ajoissa.