Bagaimana untuk menggunakan gam pemisah?
Pemindahan membran blot Barat
Di bawah tindakan arus, protein dipindahkan dari gel ke pembawa pepejal (membran).
Pemilihan membran: bahan fasa pepejal yang biasa digunakan dalam pencetakan termasuk membran NC, DBM, DDT, membran nilon, PVDF, dll. Kami memilih PVDF (polyvinylidene fluoride), yang mempunyai penjerapan protein yang lebih baik, kekuatan fizikal dan keserasian kimia yang lebih baik.Terdapat dua spesifikasi: immobilon-p (0.45um) dan immobilon PSQ (0.2um untuk MW < 20kDa).
Kaedah separuh kering
Iaitu, gabungan gel antara lapisan diletakkan di antara kertas penapis dengan penimbal pemindahan, dan arus dijalankan melalui penimbal yang terjerap pada kertas penapis untuk mencapai kesan pemindahan.Oleh kerana arus bertindak secara langsung pada gam filem, keadaan pemindahan agak keras, tetapi masa pemindahan adalah pendek dan kecekapannya tinggi.
(1) pemilihan keadaan eksperimen
Arus adalah 1ma-2ma / cm2, dan kami biasanya menggunakan 100mA / membran.Masa pemindahan boleh dipilih mengikut saiz molekul protein sasaran dan kepekatan gel, dan boleh diselaraskan dengan sewajarnya mengikut keadaan sebenar.
Saiz molekul protein sasaran (kDa), kepekatan gel dan masa pemindahan
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0.75
<20 15% 0.5
(2) operasi eksperimen
(1) Penyediaan kertas turas dan membran (penyediaan hendaklah dimulakan 20 minit sebelum elektroforesis).
A. Periksa sama ada terdapat penimbal pemindahan yang mencukupi, yang tidak disediakan dengan segera.
B. Periksa sama ada terdapat kertas turas dan membran saiz yang sesuai.
C. Rendam membran dalam metanol selama kira-kira 1-2 minit.Dan kemudian dipindahkan ke penimbal pemindahan.
D. Rendam kertas penapis pelekat dan kertas penapis membran yang sesuai ke dalam penimbal pemindahan masing-masing.
Berapa lama membran PDVF perlu direndam dalam metanol apabila memasuki penimbal pemindahan?
PVDF adalah hidrofobik, dan sukar untuk direndam dalam penimbal pemindahan.Selepas rawatan metanol, lebih mudah untuk direndam.Prarawatan PVDF adalah dengan merendam dan mengaktifkannya dengan metanol, dan kemudian mencucinya dua kali dengan air suling selepas direndam dengan teliti.Tujuan menggunakan buih metanol adalah untuk mengaktifkan kumpulan bercas positif pada membran PVDF dan menjadikannya lebih mudah untuk mengikat dengan protein bercas negatif.
Orang biasanya menggunakannya selama 5-20 minit.Ia boleh direndam pada masa yang sama seperti mengambil gam, dan dianggarkan ia akan mengambil masa kira-kira 5 minit.Kesannya tidak teruk.Pada masa lalu, beberapa rakan web menyiarkan bahawa masa pemprosesan tidak begitu penting, tetapi kuncinya ialah kualiti filem.Itu betul.Selagi membran direndam sepenuhnya, ia sepatutnya OK.
Spesifikasi PVDF Hybond berbunyi seperti berikut: "prabasahkan membran dalam 100% metanol (10 saat)".Pemahaman saya ialah OK untuk berendam sekurang-kurangnya 10 saat.Malah, tidak mengapa untuk berendam selama 10 saat atau 10 minit.
(2) Pemindahan
A. Letakkan kertas turas bawah pada alat pemindahan elektrik.Biasanya tiga lapisan digunakan.
B. Letakkan membran pada kertas turas pada membran, perhatikan agar tidak terdapat gelembung di antara membran dan kertas penapis, dan tuangkan beberapa penimbal pemindahan ke membran untuk memastikan membran basah.
C. Kupas gam, keluarkan gel tindanan dan gerakkan dengan teliti ke atas filem.
D. Potong sudut kiri atas filem dan tandakan kedudukan gam pada filem dengan pensil.
E. Tutup sekeping kertas turas pada gam pada gam.Tuangkan sedikit penimbal pemindahan dan letakkan dua keping kertas turas.
F. Pasang alat pemindahan elektrik dan pilih arus dan masa yang diperlukan mengikut keperluan.
G. Semasa proses pemindahan, perubahan voltan hendaklah diperhatikan pada bila-bila masa, dan sebarang kelainan hendaklah diselaraskan mengikut masa.
Masa siaran: Sep-07-2022
