जुदाई गोंद का उपयोग कैसे करें?- भाग ---- पहला

जुदाई गोंद का उपयोग कैसे करें?

पश्चिमी धब्बा झिल्ली स्थानांतरण

करंट की क्रिया के तहत, प्रोटीन को जेल से ठोस वाहक (झिल्ली) में स्थानांतरित किया जाता है।

मेम्ब्रेन चयन: इम्प्रिंटिंग में आमतौर पर उपयोग की जाने वाली ठोस-चरण सामग्री में NC झिल्ली, DBM, DDT, नायलॉन झिल्ली, PVDF, आदि शामिल हैं। हम PVDF (पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड) चुनते हैं, जिसमें बेहतर प्रोटीन सोखना, शारीरिक शक्ति और बेहतर रासायनिक संगतता होती है।इसके दो विनिर्देश हैं: इमोबिलोन-पी (0.45um) और इमोबिलॉन PSQ (0.2um MW <20kDa के लिए)।

एक अर्ध शुष्क विधि

यही है, जेल इंटरलेयर संयोजन को ट्रांसफर बफर के साथ फिल्टर पेपर के बीच रखा जाता है, और ट्रांसफर प्रभाव को प्राप्त करने के लिए फिल्टर पेपर पर सोखने वाले बफर के माध्यम से वर्तमान का संचालन किया जाता है।क्योंकि वर्तमान सीधे फिल्म गोंद पर कार्य करता है, स्थानांतरण की स्थिति अपेक्षाकृत कठोर होती है, लेकिन स्थानांतरण का समय कम होता है और दक्षता अधिक होती है।

(1) प्रायोगिक स्थितियों का चयन

वर्तमान 1ma-2ma / cm2 है, और हम आमतौर पर 100mA / झिल्ली का उपयोग करते हैं।स्थानांतरण समय को लक्ष्य प्रोटीन अणु और जेल एकाग्रता के आकार के अनुसार चुना जा सकता है, और वास्तविक स्थिति के अनुसार उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है।

लक्ष्य प्रोटीन आणविक आकार (केडीए), जेल एकाग्रता और स्थानांतरण समय

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) प्रायोगिक संचालन

(1) फिल्टर पेपर और मेम्ब्रेन तैयार करना (इलेक्ट्रोफोरेसिस से 20 मिनट पहले तैयारी शुरू कर दी जाएगी)।

A. जांचें कि क्या पर्याप्त ट्रांसफर बफ़र्स हैं, जो तुरंत तैयार नहीं किए गए हैं।

ख. जाँच करें कि फिल्टर पेपर और उचित आकार की झिल्ली है या नहीं।

C. मेम्ब्रेन को लगभग 1-2 मिनट के लिए मेथनॉल में डुबोएं।और फिर स्थानांतरण बफर में स्थानांतरित कर दिया गया।

डी। उपयुक्त चिपकने वाला फिल्टर पेपर और झिल्ली फिल्टर पेपर को क्रमशः स्थानांतरण बफर में भिगो दें।

स्थानांतरण बफर में प्रवेश करते समय PDVF झिल्ली को मेथनॉल में कितनी देर तक भिगोना चाहिए?

पीवीडीएफ हाइड्रोफोबिक है, और ट्रांसफर बफर में भिगोना मुश्किल है।मेथनॉल उपचार के बाद, सोखना आसान होता है।पीवीडीएफ का पूर्व उपचार इसे मेथनॉल के साथ सोखना और सक्रिय करना है, और फिर अच्छी तरह से भिगोने के बाद आसुत जल से दो बार धो लें।मेथनॉल बुलबुले का उपयोग करने का उद्देश्य पीवीडीएफ झिल्ली पर सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए समूहों को सक्रिय करना और नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए प्रोटीन से बांधना आसान बनाना है।

लोग आमतौर पर इसका इस्तेमाल 5-20 मिनट के लिए करते हैं।गोंद लेते समय इसे भिगोया जा सकता है, और अनुमान है कि इसमें लगभग 5 मिनट लगेंगे।प्रभाव बुरा नहीं है।अतीत में, कुछ वेब मित्रों ने पोस्ट किया था कि प्रसंस्करण समय ज्यादा मायने नहीं रखता था, लेकिन कुंजी फिल्म की गुणवत्ता थी।यह सच है।जब तक झिल्ली पूरी तरह से भीग चुकी है, यह ठीक होना चाहिए।

Hybond का PVDF विनिर्देश निम्नानुसार पढ़ता है: "झिल्ली को 100% मेटानॉल (10 सेकंड) में पहले से गीला करें"।मेरी समझ यह है कि कम से कम 10 सेकंड के लिए भिगोना ठीक है।वास्तव में, 10 सेकंड या 10 मिनट के लिए भिगोना ठीक है।

(2) स्थानांतरण

A. इलेक्ट्रिक ट्रांसफर इंस्ट्रूमेंट पर लोअर फिल्टर पेपर बिछाएं।आम तौर पर तीन परतों का उपयोग किया जाता है।

B. झिल्ली के खिलाफ फिल्टर पेपर पर झिल्ली बिछाएं, ध्यान दें कि झिल्ली और फिल्टर पेपर के बीच बुलबुले न हों, और झिल्ली को गीला रखने के लिए झिल्ली पर कुछ ट्रांसफर बफर डालें।

सी। गोंद को छीलें, स्टैक जेल को हटा दें और सावधानीपूर्वक इसे फिल्म पर ले जाएं।

डी। फिल्म के ऊपरी बाएं कोने को काट दें और एक पेंसिल के साथ फिल्म पर गोंद की स्थिति को चिह्नित करें।

ई। गोंद पर गोंद के खिलाफ फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा कवर करें।कुछ ट्रांसफर बफर डालें और फिल्टर पेपर के दो टुकड़े बिछाएं।

एफ। इलेक्ट्रिक ट्रांसफर इंस्ट्रूमेंट स्थापित करें और जरूरतों के अनुसार आवश्यक वर्तमान और समय का चयन करें।

जी। स्थानांतरण प्रक्रिया के दौरान, वोल्टेज परिवर्तन किसी भी समय देखा जाएगा, और किसी भी असामान्यता को समय पर समायोजित किया जाएगा।