Como usar a cola de separación?- parte 1

Como usar a cola de separación?

Transferencia de membrana Western blot

Baixo a acción da corrente, a proteína transfírese do xel ao transportador sólido (membrana).

Selección de membrana: os materiais de fase sólida de uso común na impresión inclúen membrana NC, DBM, DDT, membrana de nailon, PVDF, etc. Escollemos PVDF (fluoruro de polivinilideno), que ten unha mellor adsorción de proteínas, resistencia física e mellor compatibilidade química.Hai dúas especificacións: immobilon-p (0,45 um) e immobilon PSQ (0,2 um para MW < 20 kDa).

Método semi seco

É dicir, a combinación de capas intermedias de xel colócase entre o papel de filtro co tampón de transferencia e a corrente lévase a cabo a través do tampón adsorbido no papel de filtro para conseguir o efecto de transferencia.Debido a que a corrente actúa directamente sobre a cola da película, as condicións de transferencia son relativamente duras, pero o tempo de transferencia é curto e a eficiencia é alta.

(1) selección de condicións experimentais

A corrente é de 1ma-2ma/cm2, e normalmente usamos 100mA/membrana.O tempo de transferencia pódese seleccionar segundo o tamaño da molécula de proteína obxectivo e a concentración de xel, e pódese axustar adecuadamente segundo a situación real.

Tamaño molecular da proteína diana (kDa), concentración de xel e tempo de transferencia

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12 % 0,75

<20 15 % 0,5

(2) operación experimental

(1) Preparación de papel de filtro e membrana (a preparación comezará 20 minutos antes da electroforese).

R. Comproba se hai suficientes búfers de transferencia, que non están preparados inmediatamente.

B. Comproba se hai papel de filtro e membrana do tamaño adecuado.

C. Sumerxe a membrana en metanol durante uns 1-2 minutos.E despois transferido ao búfer de transferencia.

D. Mollar o papel de filtro adhesivo e o papel de filtro de membrana apropiados no tampón de transferencia respectivamente.

Canto tempo debe estar a membrana PDVF en remollo en metanol ao entrar no tampón de transferencia?

O PVDF é hidrófobo, e é difícil mergullarse no tampón de transferencia.Despois do tratamento con metanol, é máis fácil remollar.O pretratamento do PVDF consiste en remollalo e activalo con metanol, e despois lavalo dúas veces con auga destilada despois de empaparlo completamente.O propósito do uso de burbullas de metanol é activar os grupos cargados positivamente na membrana de PVDF e facilitar a unión con proteínas cargadas negativamente.

A xente adoita usalo durante 5-20 minutos.Pódese remollar ao mesmo tempo que se toma a cola, e calcúlase que levará uns 5 minutos.O efecto non é malo.No pasado, algúns webfriends publicaron que o tempo de procesamento non importaba moito, pero a clave era a calidade da película.Iso é certo.Mentres a membrana estea completamente empapada, debería estar ben.

A especificación de PVDF de Hybond di o seguinte: "pre mollar a membrana en metanol 100% (10 segundos)".O meu entendemento é que está ben en remollo durante polo menos 10 segundos.De feito, está ben en remollo durante 10 segundos ou 10 minutos.

(2) Transferencia

A. Coloque o papel de filtro inferior no instrumento de transferencia eléctrica.Xeralmente utilízanse tres capas.

B. Coloque a membrana sobre o papel de filtro contra a membrana, preste atención a que non queden burbullas entre a membrana e o papel de filtro e verte un pouco de tampón de transferencia sobre a membrana para manter a membrana mollada.

C. Retire a cola, retire o xel de pila e móvao con coidado sobre a película.

D. Corta a esquina superior esquerda da película e marca a posición de cola na película cun lapis.

E. Cubra un anaco de papel de filtro contra a cola da cola.Despeje un pouco de tampón de transferencia e coloque dous anacos de papel de filtro.

F. Instale o instrumento de transferencia eléctrica e seleccione a corrente e o tempo necesarios segundo as necesidades.

G. Durante o proceso de transferencia, observarase o cambio de tensión en calquera momento, e calquera anormalidade axustarase no tempo.