Как да използвате лепило за разделяне?- част 1

Как да използвате лепило за разделяне?

Western blot мембранен трансфер

Под действието на ток протеинът се прехвърля от гела към твърдия носител (мембрана).

Избор на мембрана: често използваните твърдофазни материали при отпечатване включват NC мембрана, DBM, DDT, найлонова мембрана, PVDF и др. Ние избираме PVDF (поливинилиден флуорид), който има по-добра адсорбция на протеини, физическа здравина и по-добра химическа съвместимост.Има две спецификации: immobilon-p (0,45 um) и immobilon PSQ (0,2 um за MW < 20 kDa).

Полусух метод

Това означава, че комбинацията от гел междинен слой се поставя между филтърната хартия с трансферния буфер и токът се провежда през буфера, адсорбиран върху филтърната хартия, за да се постигне ефектът на трансфер.Тъй като токът действа директно върху филмовото лепило, условията на трансфер са сравнително тежки, но времето за трансфер е кратко и ефективността е висока.

(1) избор на експериментални условия

Токът е 1ma-2ma / cm2 и обикновено използваме 100mA / мембрана.Времето за прехвърляне може да бъде избрано според размера на целевата протеинова молекула и концентрацията на гела и може да бъде коригирано по подходящ начин според действителната ситуация.

Размер на молекулата на целевия протеин (kDa), концентрация на гел и време за прехвърляне

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) експериментална експлоатация

(1) Приготвяне на филтърна хартия и мембрана (приготвянето трябва да започне 20 минути преди електрофорезата).

A. Проверете дали има достатъчно трансферни буфери, които не са приготвени веднага.

Б. Проверете дали има филтърна хартия и мембрана с подходящ размер.

C. Потопете мембраната в метанол за около 1-2 минути.И след това се прехвърля в буфера за трансфер.

D. Накиснете подходящата лепилна филтърна хартия и мембранна филтърна хартия съответно в трансферния буфер.

Колко време трябва мембраната PDVF да се накисва в метанол при влизане в трансферния буфер?

PVDF е хидрофобен и трудно се накисва в трансферния буфер.След третиране с метанол се накисва по-лесно.Предварителната обработка на PVDF е да се накисне и активира с метанол и след това да се измие два пъти с дестилирана вода след обилно накисване.Целта на използването на мехурчета с метанол е да се активират положително заредените групи на PVDF мембраната и да се улесни свързването с отрицателно заредени протеини.

Хората обикновено го използват за 5-20 минути.Може да се накисва едновременно с вземането на лепилото, като се очаква да отнеме около 5 минути.Ефектът не е лош.В миналото някои уеб приятели публикуваха, че времето за обработка няма голямо значение, но ключът е качеството на филма.Вярно е.Докато мембраната е напълно напоена, трябва да е наред.

PVDF спецификацията на Hybond гласи следното: "предварително намокрете мембраната в 100% метанол (10 секунди)".Моето разбиране е, че е добре да се накисва за поне 10 секунди.Всъщност е добре да се накиснете за 10 секунди или 10 минути.

(2) Трансфер

A. Поставете долната филтърна хартия върху инструмента за електрически трансфер.Обикновено се използват три слоя.

B. Поставете мембраната върху филтърната хартия срещу мембраната, внимавайте да няма мехурчета между мембраната и филтърната хартия и изсипете малко трансферен буфер върху мембраната, за да поддържате мембраната мокра.

C. Отлепете лепилото, отстранете натрупания гел и внимателно го преместете върху филма.

D. Отрежете горния ляв ъгъл на филма и маркирайте позицията на лепилото върху филма с молив.

Д. Покрийте парче филтърна хартия срещу лепилото върху лепилото.Изсипете малко буфер за прехвърляне и поставете две парчета филтърна хартия.

F. Инсталирайте инструмента за електрически трансфер и изберете необходимия ток и време според нуждите.

G. По време на процеса на прехвърляне промяната на напрежението трябва да се наблюдава по всяко време и всяка аномалия трябва да се коригира навреме.