Kumaha ngagunakeun lem separation?- bagian 1

Kumaha ngagunakeun lem separation?

mindahkeun mémbran blot Kulon

Dina aksi arus, protéin ditransferkeun tina gél ka pamawa padet (mémbran).

Pilihan mémbran: bahan solid-fase ilahar dipaké dina imprinting ngawengku mémbran NC, DBM, DDT, mémbran nilon, PVDF, jsb Urang milih PVDF (polyvinylidene fluorida), nu boga adsorption protéin hadé, kakuatan fisik sarta kasaluyuan kimiawi hadé.Aya dua spésifikasi: immobilon-p (0.45um) sareng immobilon PSQ (0.2um pikeun MW <20kDa).

Métode semi-garing

Nyaéta, kombinasi gél interlayer disimpen antara kertas filter jeung panyangga mindahkeun, sarta ayeuna dipigawé ngaliwatan panyangga adsorbed dina kertas filter pikeun ngahontal éfék mindahkeun.Kusabab ayeuna tindakan langsung dina lem pilem, kaayaan mindahkeun kawilang kasar, tapi waktu mindahkeun pondok tur efisiensi tinggi.

(1) pilihan kaayaan ékspérimén

Arus nyaéta 1ma-2ma / cm2, sareng urang biasana nganggo 100mA / mémbran.Waktu mindahkeun bisa dipilih nurutkeun ukuran molekul protéin target na konsentrasi gél, sarta bisa disaluyukeun appropriately nurutkeun kaayaan sabenerna.

Target ukuran molekul protéin (kDa), konsentrasi gél jeung waktu mindahkeun

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operasi ékspérimén

(1) Nyiapkeun kertas saring sareng mémbran (persiapan kedah dimimitian 20 menit sateuacan éléktroforésis).

A. Pariksa naha aya cukup panyangga mindahkeun, nu teu disiapkeun geuwat.

B. Pariksa naha aya kertas filter sarta mémbran ukuran ditangtoskeun.

C. Neuleumkeun mémbran dina métanol salila kira 1-2 menit.Lajeng dipindahkeun ka panyangga mindahkeun.

D. Soak kertas filter napel luyu jeung kertas filter mémbran kana panyangga mindahkeun mungguh.

Sabaraha lami mémbran PDVF kedah soak dina métanol nalika ngalebetkeun panyangga transfer?

PVDF nyaeta hidrofobik, sarta hese soak dina panyangga mindahkeun.Sanggeus perlakuan métanol, leuwih gampang soak.The pretreatment of PVDF nyaeta soak jeung ngaktipkeun eta kalawan métanol, lajeng ngumbah eta dua kali ku cai sulingan sanggeus soaking tuntas.Tujuan ngagunakeun gelembung métanol nyaéta pikeun ngaktipkeun gugus anu muatanana positip dina mémbran PVDF sareng ngagampangkeun ngabeungkeut protéin anu muatanana négatif.

Jalma biasana make eta pikeun 5-20 menit.Ieu bisa soaked dina waktos anu sareng nyandak lem, sarta diperkirakeun yén éta bakal nyandak ngeunaan 5 menit.Pangaruhna henteu goréng.Baheula, sababaraha réréncangan wéb ngeposkeun yén waktos ngolah henteu janten masalah, tapi koncina nyaéta kualitas pilem.Éta leres.Salami mémbran sagemblengna soaked, kudu OK.

Spésifikasi PVDF Hybond maca kieu: "pre baseuh mémbran dina 100% métanol (10 detik)".Pamahaman kuring nyaéta yén éta OK pikeun soak sahenteuna 10 detik.Kanyataanna, éta OK pikeun soak pikeun 10 detik atawa 10 menit.

(2) Mindahkeun

A. Iklas kertas filter handap dina alat mindahkeun listrik.Umumna tilu lapisan dianggo.

B. Iklas mémbran dina kertas filter ngalawan mémbran, nengetan teu boga gelembung antara mémbran jeung kertas filter, sarta tuang sababaraha panyangga mindahkeun onto mémbran tetep mémbran baseuh.

C. Mesek off lem, nyabut gél tumpukan jeung taliti mindahkeun eta onto film.

D. Neukteuk off belah kénca juru luhur film jeung cirian posisi lem dina film jeung pensil.

E. Panutup sapotong kertas filter ngalawan lem dina lem nu.Tuang sababaraha panyangga mindahkeun jeung neundeun dua lembar kertas filter.

F. Pasang alat transfer listrik sareng pilih arus sareng waktos anu diperyogikeun dumasar kana kabutuhan.

G. Salila prosés mindahkeun, robah tegangan bakal dititénan iraha wae, sarta Abnormalitas wae kudu disaluyukeun dina jangka waktu.