Si të përdorni ngjitësin ndarës?- Pjesa 1

Si të përdorni ngjitësin ndarës?

Transferimi i membranës Western Blot

Nën veprimin e rrymës, proteina transferohet nga xheli në bartësin e ngurtë (membranën).

Zgjedhja e membranës: materialet e përdorura zakonisht në fazën e ngurtë në stampim përfshijnë membranën NC, DBM, DDT, membranën najloni, PVDF, etj. Ne zgjedhim PVDF (fluorid poliviniliden), i cili ka përthithje më të mirë të proteinave, forcë fizike dhe përputhshmëri më të mirë kimike.Ka dy specifikime: immobilon-p (0.45um) dhe immobilon PSQ (0.2um për MW <20kDa).

Një metodë gjysmë e thatë

Kjo do të thotë, kombinimi i ndërshtresës së xhelit vendoset midis letrës filtri me tampon transferues dhe rryma përçohet përmes tamponit të përthithur në letrën filtri për të arritur efektin e transferimit.Për shkak se rryma vepron drejtpërdrejt në ngjitësin e filmit, kushtet e transferimit janë relativisht të ashpra, por koha e transferimit është e shkurtër dhe efikasiteti është i lartë.

(1) përzgjedhja e kushteve eksperimentale

Rryma është 1ma-2ma / cm2, dhe ne zakonisht përdorim 100mA / membranë.Koha e transferimit mund të zgjidhet sipas madhësisë së molekulës së proteinës së synuar dhe përqendrimit të xhelit, dhe mund të rregullohet në mënyrë të përshtatshme sipas situatës aktuale.

Madhësia molekulare e proteinës së synuar (kDa), përqendrimi i xhelit dhe koha e transferimit

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0.5

(2) operacion eksperimental

(1) Përgatitja e letrës filtruese dhe membranës (përgatitja duhet të fillojë 20 minuta para elektroforezës).

A. Kontrolloni nëse ka mjaftueshëm buferë transferimi, të cilët nuk përgatiten menjëherë.

B. Kontrolloni nëse ka letër filtri dhe membranë të madhësisë së duhur.

C. Zhyteni membranën në metanol për rreth 1-2 minuta.Dhe pastaj transferohet në tampon transferimi.

D. Thithni përkatësisht letrën e duhur të filtrit ngjitës dhe letrën filtri membranore në tampon transferues.

Sa kohë duhet të zhytet membrana PDVF në metanol kur hyn në tampon transferues?

PVDF është hidrofobik dhe është e vështirë të zhytet në tampon transferues.Pas trajtimit me metanol, është më e lehtë të thithet.Trajtimi paraprak i PVDF është ta njomni dhe aktivizoni me metanol dhe më pas ta lani dy herë me ujë të distiluar pasi ta njomni plotësisht.Qëllimi i përdorimit të flluskave të metanolit është të aktivizojë grupet e ngarkuara pozitivisht në membranën PVDF dhe ta bëjë më të lehtë lidhjen me proteinat e ngarkuara negativisht.

Njerëzit zakonisht e përdorin atë për 5-20 minuta.Mund të ngjyhet në të njëjtën kohë me marrjen e ngjitësit dhe llogaritet se do të zgjasë rreth 5 minuta.Efekti nuk është i keq.Në të kaluarën, disa miq në internet postuan se koha e përpunimit nuk kishte shumë rëndësi, por çelësi ishte cilësia e filmit.Kjo është e vërtetë.Për sa kohë që membrana është njomur plotësisht, duhet të jetë në rregull.

Specifikimi PVDF i Hybond lexon si më poshtë: "para lagni membranën në 100% metanol (10 sekonda)".Kuptimi im është se është në rregull të zhyteni për të paktën 10 sekonda.Në fakt, është në rregull të zhyteni për 10 sekonda ose 10 minuta.

(2) Transferimi

A. Vendosni letrën e poshtme të filtrit në instrumentin elektrik të transferimit.Zakonisht përdoren tre shtresa.

B. Vendoseni membranën në letër filtri kundër membranës, kushtojini vëmendje që të mos ketë flluska midis membranës dhe letrës filtri dhe derdhni pak bufer transferimi mbi membranë për ta mbajtur membranën të lagësht.

C. Qëroni ngjitësin, hiqni xhelin e pirgut dhe vendoseni me kujdes mbi film.

D. Prisni këndin e sipërm të majtë të filmit dhe shënoni pozicionin e ngjitësit në film me një laps.

E. Mbuloni një copë letër filtri kundër ngjitësit në ngjitës.Hidhni pak buffer transferimi dhe vendosni dy copa letre filtri.

F. Instaloni instrumentin elektrik të transferimit dhe zgjidhni rrymën dhe kohën e kërkuar sipas nevojave.

G. Gjatë procesit të transferimit, ndryshimi i tensionit duhet të vërehet në çdo kohë dhe çdo anomali duhet të rregullohet në kohë.