Kako koristiti ljepilo za razdvajanje?– 1. dio

Kako koristiti ljepilo za razdvajanje?

Western blot membranski transfer

Pod dejstvom struje, protein se sa gela prenosi na čvrsti nosač (membranu).

Izbor membrane: najčešće korišteni materijali čvrste faze u otiskivanju uključuju NC membrane, DBM, DDT, najlonske membrane, PVDF, itd. Mi biramo PVDF (poliviniliden fluorid), koji ima bolju adsorpciju proteina, fizičku snagu i bolju hemijsku kompatibilnost.Postoje dvije specifikacije: immobilon-p (0,45um) i immobilon PSQ (0,2um za MW < 20kDa).

Polusuha metoda

Odnosno, kombinacija međusloja gela se postavlja između filter papira i pufera za prijenos, a struja se provodi kroz pufer adsorbiran na filter papiru kako bi se postigao prijenosni učinak.Budući da struja djeluje direktno na filmski ljepilo, uvjeti prijenosa su relativno teški, ali vrijeme prijenosa je kratko, a efikasnost je visoka.

(1) izbor eksperimentalnih uslova

Struja je 1ma-2ma/cm2, a obično koristimo 100mA/membrana.Vrijeme prijenosa može se odabrati u skladu s veličinom ciljnog proteinskog molekula i koncentracijom gela, a može se prilagoditi na odgovarajući način prema stvarnoj situaciji.

Ciljana molekularna veličina proteina (kDa), koncentracija gela i vrijeme prijenosa

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0.5

(2) eksperimentalni rad

(1) Priprema filter papira i membrane (pripremu treba započeti 20 minuta prije elektroforeze).

O. Provjerite ima li dovoljno bafera za prijenos, koji se ne pripremaju odmah.

B. Provjerite ima li filter papira i membrane odgovarajuće veličine.

C. Uronite membranu u metanol na oko 1-2 minute.A zatim prebačen u bafer za prijenos.

D. Natopite odgovarajući ljepljivi filter papir i membranski filter papir u prijenosni pufer.

Koliko dugo PDVF membrana treba namakati u metanolu pri ulasku u prijenosni pufer?

PVDF je hidrofoban i teško ga je potopiti u pufer za prijenos.Nakon tretmana metanolom, lakše se natapa.Predtretman PVDF-a je da se natopi i aktivira metanolom, a zatim se dva puta ispere destilovanom vodom nakon temeljnog namakanja.Svrha upotrebe mjehurića metanola je aktiviranje pozitivno nabijenih grupa na PVDF membrani i olakšavanje vezivanja s negativno nabijenim proteinima.

Ljudi ga obično koriste 5-20 minuta.Može se natopiti istovremeno sa uzimanjem ljepila, a procjenjuje se da će za to trebati oko 5 minuta.Efekat nije loš.U prošlosti su neki web-prijatelji objavili da vrijeme obrade nije bitno, ali je ključ bio kvalitet filma.To je istina.Sve dok je membrana potpuno natopljena, trebalo bi da bude u redu.

Hybond PVDF specifikacija glasi kako slijedi: "prethodno navlažite membranu u 100% metanolu (10 sekundi)".Koliko sam shvatio, u redu je namakati najmanje 10 sekundi.U stvari, u redu je namakati se 10 sekundi ili 10 minuta.

(2) Transfer

A. Položite donji filter papir na električni instrument za prijenos.Obično se koriste tri sloja.

B. Položite membranu na filter papir uz membranu, pazite da nema mjehurića između membrane i filter papira i sipajte malo pufera za prijenos na membranu kako bi membrana ostala vlažna.

C. Skinite ljepilo, uklonite gel za naslagane slojeve i pažljivo ga premjestite na film.

D. Odrežite gornji lijevi ugao filma i označite mjesto ljepila na filmu olovkom.

E. Pokrijte komad filter papira protiv ljepila na ljepilu.Sipajte malo prijenosnog pufera i položite dva komada filter papira.

F. Instalirajte električni prijenosni instrument i odaberite potrebnu struju i vrijeme prema potrebama.

G. Tokom procesa prenosa, promena napona će se posmatrati u bilo kom trenutku, i svaka abnormalnost mora biti prilagođena na vreme.