Kako uporabljati ločilno lepilo?
Western blot membranski prenos
Pod delovanjem toka se beljakovina prenese iz gela na trdni nosilec (membrano).
Izbira membrane: običajno uporabljeni trdnofazni materiali pri odtiskovanju vključujejo NC membrano, DBM, DDT, najlonsko membrano, PVDF itd. Izberemo PVDF (poliviniliden fluorid), ki ima boljšo adsorpcijo beljakovin, fizično moč in boljšo kemično kompatibilnost.Obstajata dve specifikaciji: immobilon-p (0,45 um) in immobilon PSQ (0,2 um za MW < 20 kDa).
Polsuha metoda
To pomeni, da je kombinacija vmesnega sloja gela nameščena med filtrirni papir s pufrom za prenos, tok pa poteka skozi pufer, adsorbiran na filtrirnem papirju, da se doseže učinek prenosa.Ker tok deluje neposredno na filmsko lepilo, so pogoji prenosa relativno težki, vendar je čas prenosa kratek in učinkovitost visoka.
(1) izbira eksperimentalnih pogojev
Tok je 1ma-2ma/cm2, običajno pa uporabljamo 100mA/membrano.Čas prenosa je mogoče izbrati glede na velikost ciljne proteinske molekule in koncentracijo gela ter ga je mogoče ustrezno prilagoditi glede na dejansko stanje.
Ciljna molekularna velikost proteina (kDa), koncentracija gela in čas prenosa
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15—40 12 % 0,75
<20 15 % 0,5
(2) poskusno delovanje
(1) Priprava filtrirnega papirja in membrane (pripravo začnemo 20 minut pred elektroforezo).
A. Preverite, ali je dovolj medpomnilnikov za prenos, ki niso pripravljeni takoj.
B. Preverite, ali sta filter papir in membrana ustrezne velikosti.
C. Membrano potopite v metanol za približno 1-2 minuti.In nato prenesen v medpomnilnik za prenos.
D. Namočite ustrezen lepilni filtrirni papir oziroma membranski filtrirni papir v pufer za prenos.
Kako dolgo naj se membrana PDVF namaka v metanolu, ko vstopi v pufer za prenos?
PVDF je hidrofoben in ga je težko namakati v pufru za prenos.Po obdelavi z metanolom je lažje namakati.Predobdelava PVDF je, da ga namočimo in aktiviramo z metanolom, nato pa ga po temeljitem namakanju dvakrat speremo z destilirano vodo.Namen uporabe metanolnih mehurčkov je aktivirati pozitivno nabite skupine na PVDF membrani in olajšati vezavo z negativno nabitimi proteini.
Ljudje ga običajno uporabljajo 5-20 minut.Namočimo ga lahko hkrati z jemanjem lepila, predvidoma pa bo trajalo približno 5 minut.Učinek ni slab.V preteklosti so nekateri spletni prijatelji objavili, da čas obdelave ni pomemben, ampak je ključna kakovost filma.To je res.Dokler je membrana popolnoma namočena, mora biti v redu.
Hybond PVDF specifikacija se glasi takole: "predhodno zmočite membrano v 100% metanolu (10 sekund)".Kolikor razumem, je v redu namakati vsaj 10 sekund.Pravzaprav je v redu, če se namakate 10 sekund ali 10 minut.
(2) Prenos
A. Položite spodnji filter papir na instrument za električni prenos.Na splošno se uporabljajo tri plasti.
B. Položite membrano na filtrirni papir proti membrani, pazite, da med membrano in filtrirnim papirjem ne bo mehurčkov, in nalijte nekaj pufra za prenos na membrano, da ostane membrana mokra.
C. Odlepite lepilo, odstranite plast gela in ga previdno premaknite na film.
D. Odrežite zgornji levi kot filma in s svinčnikom označite položaj lepila na filmu.
E. Pokrijte kos filtrirnega papirja proti lepilu na lepilu.Nalijte nekaj pufra za prenos in položite dva kosa filtrirnega papirja.
F. Namestite instrument za električni prenos in izberite zahtevani tok in čas glede na potrebe.
G. Med postopkom prenosa je treba kadar koli opazovati spremembo napetosti in morebitne nenormalnosti je treba pravočasno prilagoditi.
Čas objave: 7. september 2022
