كيفية استخدام غراء الفصل؟
نقل غشاء اللطخة الغربية
تحت تأثير التيار ، ينتقل البروتين من الهلام إلى المادة الحاملة الصلبة (الغشاء).
اختيار الغشاء: المواد الصلبة المستخدمة بشكل شائع في البصمة تشمل غشاء NC ، DBM ، DDT ، غشاء النايلون ، PVDF ، إلخ. نختار PVDF (فلوريد البولي فينيلدين) ، الذي يتميز بامتصاص بروتين أفضل ، قوة فيزيائية وتوافق كيميائي أفضل.هناك نوعان من المواصفات: immobilon-p (0.45um) و immobilon PSQ (0.2um لـ MW <20kDa).
طريقة شبه جافة
بمعنى ، يتم وضع تركيبة الطبقة البينية للهلام بين ورق الترشيح مع المخزن المؤقت للنقل ، ويتم إجراء التيار من خلال المخزن المؤقت الممتص على ورق الترشيح لتحقيق تأثير النقل.نظرًا لأن التيار يعمل مباشرة على غراء الفيلم ، فإن ظروف النقل قاسية نسبيًا ، لكن وقت النقل قصير والكفاءة عالية.
(1) اختيار الظروف التجريبية
التيار هو 1ma-2ma / cm2 ، وعادة ما نستخدم 100mA / الغشاء.يمكن تحديد وقت النقل وفقًا لحجم جزيء البروتين المستهدف وتركيز الهلام ، ويمكن تعديله بشكل مناسب وفقًا للحالة الفعلية.
الحجم الجزيئي للبروتين المستهدف (كيلو دالتون) وتركيز الهلام ووقت النقل
80 - 140 8٪ 1.5-2.0
25 - 80 10٪ 1.5
15-40 12٪ 0.75
<20 15٪ 0.5
(2) العملية التجريبية
(1) تحضير ورق الترشيح والغشاء (يبدأ التحضير قبل 20 دقيقة من الرحلان الكهربائي).
أ. تحقق مما إذا كان هناك ما يكفي من المخازن المؤقتة للنقل ، والتي لم يتم تحضيرها على الفور.
ب. تحقق مما إذا كان هناك ورق ترشيح وغشاء بالحجم المناسب.
ج. اغمر الغشاء في الميثانول لمدة 1-2 دقيقة.ثم نقلها إلى المخزن المؤقت للنقل.
د. انقع ورق الترشيح اللاصق الملائم وورق الترشيح الغشائي في مخزن النقل المؤقت على التوالي.
ما هي المدة التي يجب أن ينقع فيها غشاء PDVF في الميثانول عند دخوله في المخزن المؤقت للنقل؟
PVDF كاره للماء ، ومن الصعب نقعه في مخزن النقل المؤقت.بعد معالجة الميثانول ، يصبح النقع أسهل.المعالجة المسبقة لـ PVDF هي نقعها وتنشيطها بالميثانول ، ثم غسلها مرتين بالماء المقطر بعد النقع جيدًا.الغرض من استخدام فقاعات الميثانول هو تنشيط المجموعات الموجبة الشحنة على غشاء PVDF وتسهيل الارتباط بالبروتينات سالبة الشحنة.
يستخدمه الناس عادة لمدة 5-20 دقيقة.يمكن نقعه في نفس وقت أخذ الصمغ ، ويقدر أنه سيستغرق حوالي 5 دقائق.التأثير ليس سيئا.في الماضي ، نشر بعض أصدقاء الويب أن وقت المعالجة لا يهم كثيرًا ، لكن المفتاح كان جودة الفيلم.هذا صحيح.طالما أن الغشاء مبلل تمامًا ، يجب أن يكون جيدًا.
تنص مواصفات Hybond's PVDF على ما يلي: "بلل الغشاء مسبقًا في 100٪ ميتانول (10 ثوانٍ)".ما أفهمه هو أنه لا بأس من النقع لمدة 10 ثوانٍ على الأقل.في الواقع ، لا بأس من النقع لمدة 10 ثوانٍ أو 10 دقائق.
(2) التحويل
أ. ضع ورقة الترشيح السفلية على أداة النقل الكهربائية.بشكل عام يتم استخدام ثلاث طبقات.
ب. ضع الغشاء على ورق الترشيح مقابل الغشاء ، وانتبه إلى عدم وجود فقاعات بين الغشاء وورق الترشيح ، واسكب بعض عازلة النقل على الغشاء للحفاظ على الغشاء رطبًا.
ج. انزع الصمغ وأزل جل المكدس وانقله بحذر إلى الغشاء.
د. اقطع الزاوية اليسرى العلوية للفيلم وحدد موضع الغراء على الفيلم بقلم رصاص.
قم بتغطية قطعة من ورق الترشيح على الصمغ.صب بعض المخزن المؤقت للنقل ووضع قطعتين من ورق الترشيح.
و. تركيب أداة التحويل الكهربائي واختيار التيار والوقت المطلوب حسب الحاجة.
أثناء عملية النقل ، يجب ملاحظة تغيير الجهد في أي وقت ، ويجب تعديل أي خلل في الوقت المناسب.
الوقت ما بعد: سبتمبر-07-2022
