Cum se folosește adeziv de separare?
Transferul membranei Western blot
Sub acțiunea curentului, proteina este transferată din gel pe purtătorul solid (membrană).
Selectarea membranei: materialele în fază solidă utilizate în mod obișnuit în imprimare includ membrană NC, DBM, DDT, membrană de nailon, PVDF etc. Alegem PVDF (fluorura de poliviniliden), care are o mai bună adsorbție a proteinelor, rezistență fizică și compatibilitate chimică mai bună.Există două specificații: immobilon-p (0.45um) și immobilon PSQ (0.2um pentru MW < 20kDa).
O metodă semi-uscată
Adică, combinația de gel interstrat este plasată între hârtia de filtru cu tamponul de transfer, iar curentul este condus prin tamponul adsorbit pe hârtia de filtru pentru a obține efectul de transfer.Deoarece curentul acționează direct asupra lipiciului de film, condițiile de transfer sunt relativ dure, dar timpul de transfer este scurt și eficiența este mare.
(1) selectarea condițiilor experimentale
Curentul este de 1ma-2ma/cm2, iar de obicei folosim 100mA/membrană.Timpul de transfer poate fi selectat în funcție de dimensiunea moleculei de proteină țintă și de concentrația gelului și poate fi ajustat corespunzător în funcție de situația actuală.
Dimensiunea moleculară a proteinei țintă (kDa), concentrația gelului și timpul de transfer
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1,5
15—40 12% 0,75
<20 15% 0,5
(2) operațiune experimentală
(1) Pregătirea hârtiei de filtru și a membranei (pregătirea trebuie începută cu 20 de minute înainte de electroforeză).
A. Verificați dacă există suficiente tampoane de transfer, care nu sunt pregătite imediat.
B. Verificați dacă există hârtie de filtru și membrană de dimensiunea adecvată.
C. Se scufundă membrana în metanol timp de aproximativ 1-2 minute.Și apoi transferat în tamponul de transfer.
D. Înmuiați hârtia de filtru adezivă corespunzătoare și, respectiv, hârtia de filtru cu membrană în tamponul de transfer.
Cât timp trebuie să se înmoaie membrana PDVF în metanol când intră în tamponul de transfer?
PVDF este hidrofob și este dificil de înmuiat în tamponul de transfer.După tratarea cu metanol, este mai ușor de înmuiat.Pretratamentul PVDF este să-l înmuiați și să îl activați cu metanol, apoi să îl spălați de două ori cu apă distilată după înmuierea temeinică.Scopul utilizării bulelor de metanol este de a activa grupările încărcate pozitiv de pe membrana PVDF și de a facilita legarea cu proteinele încărcate negativ.
Oamenii îl folosesc de obicei timp de 5-20 de minute.Poate fi înmuiat în același timp cu luarea lipiciului și se estimează că va dura aproximativ 5 minute.Efectul nu este rău.În trecut, unii prieteni de pe web au postat că timpul de procesare nu a contat prea mult, dar cheia era calitatea filmului.Este adevărat.Atâta timp cât membrana este complet înmuiată, ar trebui să fie OK.
Specificația PVDF a lui Hybond arată după cum urmează: „pre umezit membrana în 100% metanol (10 secunde)”.Înțeleg că este în regulă să se înmoaie cel puțin 10 secunde.De fapt, este în regulă să se înmoaie timp de 10 secunde sau 10 minute.
(2) Transfer
A. Așezați hârtia de filtru inferioară pe instrumentul de transfer electric.În general, sunt utilizate trei straturi.
B. Așezați membrana pe hârtie de filtru pe membrană, acordați atenție să nu existe bule între membrană și hârtie de filtru și turnați puțin tampon de transfer pe membrană pentru a menține membrana umedă.
C. Îndepărtați lipiciul, îndepărtați gelul de stivă și mutați-l cu grijă pe film.
D. Tăiați colțul din stânga sus al filmului și marcați poziția adezivului pe film cu un creion.
E. Acoperiți o bucată de hârtie de filtru cu lipiciul de pe lipici.Turnați puțin tampon de transfer și așezați două bucăți de hârtie de filtru.
F. Instalați instrumentul de transfer electric și selectați curentul și timpul necesar în funcție de necesități.
G. În timpul procesului de transfer, schimbarea tensiunii va fi observată în orice moment și orice anomalie va fi ajustată în timp.
Ora postării: 07-sept-2022
