جدائي گلو ڪيئن استعمال ڪجي؟- حصو 1

جدائي گلو ڪيئن استعمال ڪجي؟

مغربي بلٽ جھلي جي منتقلي

موجوده جي عمل جي تحت، پروٽين کي جيل کان مضبوط ڪيريئر (جھلي) ڏانهن منتقل ڪيو ويندو آهي.

جھلي جي چونڊ: عام طور تي استعمال ٿيندڙ سولڊ فيز مواد امپرنٽنگ ۾ شامل آھن NC جھلي، DBM، DDT، نائلون جھلي، PVDF وغيره. اسان PVDF (پولي وينائلائيڊين فلورائڊ) چونڊيندا آھيون، جنھن ۾ بھترين پروٽين جي جذب، جسماني طاقت ۽ بھترين ڪيميائي مطابقت آھي.هتي ٻه وضاحتون آهن: immobilon-p (0.45um) ۽ immobilon PSQ (0.2um ميگاواٽ <20kDa لاءِ).

نيم خشڪ طريقو

اهو آهي، جيل انٽرليئر ميلاپ کي منتقلي بفر سان فلٽر پيپر جي وچ ۾ رکيل آهي، ۽ موجوده منتقلي اثر حاصل ڪرڻ لاء فلٽر پيپر تي جذب ٿيل بفر ذريعي ڪيو ويندو آهي.ڇاڪاڻ ته موجوده ڪم سڌو سنئون فلم گلو تي، منتقلي حالتون نسبتا سخت آهن، پر منتقلي وقت ننڍو آهي ۽ ڪارڪردگي اعلي آهي.

(1) تجرباتي حالتن جو انتخاب

موجوده 1ma-2ma / cm2 آهي، ۽ اسان عام طور تي 100mA / جھلي استعمال ڪندا آهيون.جي منتقلي وقت ٽارگيٽ پروٽين انو ۽ جيل ڪنسنٽريشن جي سائيز جي مطابق چونڊي سگهجي ٿو، ۽ صحيح صورتحال مطابق ترتيب ڏئي سگهجي ٿو.

ٽارگيٽ پروٽين جي ماليڪيولر سائيز (kDa)، جيل ڪنسنٽريشن ۽ منتقلي جو وقت

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15-40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) تجرباتي آپريشن

(1) فلٽر پيپر ۽ جھلي جي تياري (تيار ڪرڻ 20 منٽ اڳ الیکٹروفورسس شروع ڪيو ويندو).

A. چيڪ ڪريو ته ڇا ڪافي منتقلي بفر آهن، جيڪي فوري طور تي تيار نه ڪيا ويا آهن.

B. چيڪ ڪريو ته فلٽر پيپر ۽ جھلي مناسب سائيز جو آھي.

C. جھلي کي ميٿانول ۾ اٽڪل 1-2 منٽن لاءِ وجھو.۽ پوء منتقلي بفر ڏانهن منتقل ڪيو ويو.

D. مناسب چپڪندڙ فلٽر پيپر ۽ ميبرين فلٽر پيپر کي ترتيب سان منتقلي بفر ۾ لڪايو.

منتقلي بفر ۾ داخل ٿيڻ وقت پي ڊي وي ايف جھلي کي ميٿانول ۾ ڪيترو ڊگهو رکڻ گهرجي؟

PVDF هائيڊروفوبڪ آهي، ۽ ان کي منتقلي بفر ۾ ڇڪڻ ڏکيو آهي.ميٿانول جي علاج کان پوء، ان کي آسان ڪرڻ آسان آهي.PVDF جو اڳواٽ علاج اهو آهي ته ان کي ميٿانول سان لڪايو ۽ چالو ڪيو وڃي، ۽ پوءِ ان کي چڱيءَ طرح ٻرڻ کان پوءِ ڊسٽل پاڻي سان ٻه ڀيرا ڌوئي.ميٿانول بلبل استعمال ڪرڻ جو مقصد PVDF جھلي تي مثبت طور تي چارج ٿيل گروپن کي چالو ڪرڻ ۽ منفي طور تي چارج ٿيل پروٽينن سان پابند ڪرڻ آسان بڻائي ٿو.

ماڻهو عام طور تي 5-20 منٽن لاء استعمال ڪندا آهن.اهو گلو کڻڻ سان گڏ هڪ ئي وقت ۾ لڪي سگهجي ٿو، ۽ اندازو لڳايو ويو آهي ته اهو اٽڪل 5 منٽ وٺندو.اثر خراب نه آهي.ماضي ۾، ڪجهه ويب دوستن پوسٽ ڪيو ته پروسيسنگ وقت گهڻو فرق نه هو، پر اهم فلم جي معيار هئي.اھو سچ آھي.جيستائين جھلي پوريءَ طرح لڪي وڃي، تيستائين ٺيڪ رھڻ گھرجي.

هائيبونڊ جي پي وي ڊي ايف جي وضاحت هن ريت آهي: "100٪ ميٽانول (10 سيڪنڊن) ۾ جھلي کي اڳ ۾ ويٽ ڪيو".منهنجي سمجھ اها آهي ته اهو ٺيڪ آهي گهٽ ۾ گهٽ 10 سيڪنڊن لاءِ سمهڻ.حقيقت ۾، اهو ٺيڪ آهي 10 سيڪنڊن يا 10 منٽن لاء.

(2) منتقلي

A. هيٺئين فلٽر پيپر کي اليڪٽرڪ ٽرانسفر اوزار تي رکو.عام طور تي ٽي پرت استعمال ٿيندا آهن.

B. جھلي کي فلٽر پيپر تي جھلي جي سامهون رکو، ڌيان ڏيو ته جھلي ۽ فلٽر پيپر جي وچ ۾ بلبل نه آھن، ۽ جھلي کي نم رکڻ لاء جھلي تي ڪجھ منتقلي بفر وجھو.

C. گلو کي هٽايو، اسٽيڪ جيل کي هٽايو ۽ ان کي احتياط سان فلم تي منتقل ڪريو.

D. فلم جي مٿين کاٻي ڪنڊ کي ڪٽيو ۽ پنسل سان فلم تي گلو پوزيشن کي نشان لڳايو.

E. فلٽر پيپر جو هڪ ٽڪرو ڍڪيو گلو تي گلو جي خلاف.ڪجهه منتقلي بفر اڇو ۽ فلٽر پيپر جا ٻه ٽڪرا رکو.

F. بجليءَ جي منتقلي وارو اوزار انسٽال ڪريو ۽ ضرورتن مطابق گهربل موجوده ۽ وقت چونڊيو.

G. منتقلي جي عمل دوران، وولٹیج جي تبديلي کي ڪنهن به وقت ڏٺو ويندو، ۽ ڪنهن به غير معمولي کي وقت ۾ ترتيب ڏنو ويندو.