چگونه از چسب جداکننده استفاده کنیم؟- قسمت 1

چگونه از چسب جداکننده استفاده کنیم؟

انتقال غشای وسترن بلات

تحت تأثیر جریان، پروتئین از ژل به حامل جامد (غشاء) منتقل می شود.

انتخاب غشاء: مواد فاز جامد معمولاً مورد استفاده در چاپ عبارتند از غشاء NC، DBM، DDT، غشای نایلونی، PVDF، و غیره.دو مشخصات وجود دارد: immobilon-p (0.45um) و immobilon PSQ (0.2um برای MW <20kDa).

روش نیمه خشک

یعنی ترکیب لایه‌ای ژل بین کاغذ صافی با بافر انتقال قرار می‌گیرد و جریان از طریق بافر جذب شده روی کاغذ صافی برای رسیدن به اثر انتقال هدایت می‌شود.از آنجایی که جریان مستقیماً بر روی چسب فیلم تأثیر می گذارد، شرایط انتقال نسبتاً سخت است، اما زمان انتقال کوتاه و راندمان بالا است.

(1) انتخاب شرایط تجربی

جریان 1ma-2ma / cm2 است و ما معمولاً از 100mA / غشاء استفاده می کنیم.زمان انتقال را می توان با توجه به اندازه مولکول پروتئین هدف و غلظت ژل انتخاب کرد و با توجه به وضعیت واقعی می توان آن را به طور مناسب تنظیم کرد.

اندازه مولکولی پروتئین هدف (kDa)، غلظت ژل و زمان انتقال

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15-40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) عملیات آزمایشی

(1) تهیه کاغذ صافی و غشاء (آماده سازی باید 20 دقیقه قبل از الکتروفورز شروع شود).

الف. بررسی کنید که آیا بافرهای انتقال کافی وجود دارد که بلافاصله آماده نشده اند.

ب. بررسی کنید که آیا کاغذ فیلتر و غشاء با اندازه مناسب وجود دارد یا خیر.

ج- غشا را حدود 1-2 دقیقه در متانول غوطه ور کنید.و سپس به بافر انتقال منتقل می شود.

د. کاغذ صافی چسب مناسب و کاغذ صافی غشایی را به ترتیب در بافر انتقال خیس کنید.

غشای PDVF هنگام ورود به بافر انتقال چه مدت باید در متانول خیس بخورد؟

PVDF آبگریز است و خیساندن آن در بافر انتقال دشوار است.پس از درمان با متانول، خیساندن آن آسان تر است.پیش تصفیه PVDF به این صورت است که آن را با متانول خیسانده و فعال می کنند و پس از خیساندن کامل آن را دو بار با آب مقطر بشویید.هدف از استفاده از حباب‌های متانول فعال کردن گروه‌های دارای بار مثبت روی غشای PVDF و آسان‌تر شدن اتصال با پروتئین‌های دارای بار منفی است.

مردم معمولاً 5-20 دقیقه از آن استفاده می کنند.می توان آن را همزمان با گرفتن چسب خیس کرد و تخمین زده می شود که حدود 5 دقیقه طول بکشد.تاثیرش بد نیستدر گذشته، برخی از دوستان وب پست کردند که زمان پردازش اهمیت چندانی ندارد، اما نکته کلیدی کیفیت فیلم است.درست است.تا زمانی که غشاء کاملاً خیس شده باشد، باید اوکی باشد.

مشخصات PVDF Hybond به شرح زیر است: "غشا را از قبل خیس کنید در 100٪ متانول (10 ثانیه)".درک من این است که خیساندن برای حداقل 10 ثانیه اشکالی ندارد.در واقع، خیساندن به مدت 10 ثانیه یا 10 دقیقه اشکالی ندارد.

(2) انتقال

الف. کاغذ صافی پایینی را روی ابزار انتقال الکتریکی قرار دهید.به طور کلی از سه لایه استفاده می شود.

ب- ممبران را روی کاغذ صافی در مقابل ممبران قرار دهید، توجه داشته باشید که بین ممبران و کاغذ صافی حباب نداشته باشد و مقداری بافر انتقال را روی ممبران بریزید تا غشا خیس بماند.

ج. چسب را جدا کنید، ژل پشته را بردارید و با دقت روی فیلم حرکت دهید.

د- گوشه سمت چپ بالای فیلم را ببرید و با مداد محل چسب را روی فیلم مشخص کنید.

E. یک تکه کاغذ صافی را در برابر چسب روی چسب بپوشانید.مقداری بافر انتقال بریزید و دو تکه کاغذ صافی بگذارید.

و- ابزار انتقال الکتریکی را نصب کنید و جریان و زمان مورد نیاز را با توجه به نیاز انتخاب کنید.

ز- در طول فرآیند انتقال، تغییر ولتاژ باید در هر زمان مشاهده شود و هر گونه غیر عادی باید به موقع تنظیم شود.