Paano gamitin ang separation glue?- bahagi 1

Paano gamitin ang separation glue?

Western blot membrane transfer

Sa ilalim ng pagkilos ng kasalukuyang, ang protina ay inililipat mula sa gel sa solid carrier (membrane).

Pagpili ng lamad: ang karaniwang ginagamit na solid-phase na materyales sa imprinting ay kinabibilangan ng NC membrane, DBM, DDT, nylon membrane, PVDF, atbp. Pinipili namin ang PVDF (polyvinylidene fluoride), na may mas mahusay na adsorption ng protina, pisikal na lakas at mas mahusay na chemical compatibility.Mayroong dalawang mga detalye: immobilon-p (0.45um) at immobilon PSQ (0.2um para sa MW < 20kDa).

Isang semi-dry na paraan

Iyon ay, ang kumbinasyon ng gel interlayer ay inilalagay sa pagitan ng filter na papel na may transfer buffer, at ang kasalukuyang ay isinasagawa sa pamamagitan ng buffer adsorbed sa filter na papel upang makamit ang epekto ng paglipat.Dahil ang kasalukuyang kumikilos nang direkta sa film glue, ang mga kondisyon ng paglipat ay medyo malupit, ngunit ang oras ng paglipat ay maikli at ang kahusayan ay mataas.

(1) pagpili ng mga pang-eksperimentong kondisyon

Ang kasalukuyang ay 1ma-2ma / cm2, at karaniwang ginagamit namin ang 100mA / lamad.Ang oras ng paglipat ay maaaring mapili ayon sa laki ng target na molekula ng protina at ang konsentrasyon ng gel, at maaaring iakma nang naaangkop ayon sa aktwal na sitwasyon.

Target na laki ng molekular ng protina (kDa), konsentrasyon ng gel at oras ng paglipat

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) pang-eksperimentong operasyon

(1) Paghahanda ng filter na papel at lamad (ang paghahanda ay dapat magsimula 20 minuto bago ang electrophoresis).

A. Suriin kung mayroong sapat na mga buffer sa paglilipat, na hindi kaagad inihanda.

B. Suriin kung mayroong filter na papel at lamad ng wastong sukat.

C. Ilubog ang lamad sa methanol nang mga 1-2 minuto.At pagkatapos ay inilipat sa transfer buffer.

D. Ibabad ang naaangkop na pandikit na filter paper at membrane filter paper sa transfer buffer ayon sa pagkakabanggit.

Gaano katagal dapat magbabad ang lamad ng PDVF sa methanol kapag pumapasok sa transfer buffer?

Ang PVDF ay hydrophobic, at mahirap ibabad sa transfer buffer.Pagkatapos ng methanol treatment, mas madaling magbabad.Ang pretreatment ng PVDF ay ibabad at i-activate ito ng methanol, at pagkatapos ay hugasan ito ng dalawang beses gamit ang distilled water pagkatapos ibabad ng maigi.Ang layunin ng paggamit ng mga bula ng methanol ay upang i-activate ang mga positibong sisingilin na grupo sa PVDF membrane at gawing mas madali ang pagbubuklod sa mga negatibong sisingilin na protina.

Karaniwang ginagamit ito ng mga tao sa loob ng 5-20 minuto.Maaari itong ibabad kasabay ng pagkuha ng pandikit, at tinatayang aabot ito ng mga 5 minuto.Hindi masama ang epekto.Noong nakaraan, ilang mga kaibigan sa web ang nag-post na ang oras ng pagproseso ay hindi mahalaga, ngunit ang susi ay ang kalidad ng pelikula.Totoo yan.Hangga't ang lamad ay ganap na nababad, ito ay dapat na OK.

Ang detalye ng PVDF ng Hybond ay nagbabasa ng mga sumusunod: "pre wet the membrane in 100% metanol (10 seconds)".Ang pagkakaintindi ko ay OK lang magbabad ng hindi bababa sa 10 segundo.Kung tutuusin, OK lang magbabad ng 10 segundo o 10 minuto.

(2) Paglipat

A. Ilagay ang ibabang filter paper sa electric transfer instrument.Karaniwang tatlong layer ang ginagamit.

B. Ilagay ang lamad sa filter na papel laban sa lamad, bigyang-pansin na huwag magkaroon ng mga bula sa pagitan ng lamad at ng filter na papel, at ibuhos ang ilang transfer buffer sa lamad upang panatilihing basa ang lamad.

C. Peel off ang pandikit, alisin ang stack gel at maingat na ilipat ito papunta sa pelikula.

D. Gupitin ang kaliwang sulok sa itaas ng pelikula at markahan ang posisyon ng pandikit sa pelikula gamit ang isang lapis.

E. Takpan ang isang piraso ng filter na papel laban sa pandikit sa pandikit.Ibuhos ang ilang transfer buffer at maglatag ng dalawang piraso ng filter na papel.

F. I-install ang electric transfer instrument at piliin ang kinakailangang kasalukuyang at oras ayon sa mga pangangailangan.

G. Sa panahon ng proseso ng paglipat, ang pagbabago ng boltahe ay dapat sundin anumang oras, at anumang abnormalidad ay dapat iakma sa oras.