Ako používať separačné lepidlo?- časť 1

Ako používať separačné lepidlo?

Prenos membrány Western blot

Pôsobením prúdu sa proteín prenesie z gélu na pevný nosič (membránu).

Výber membrány: k bežne používaným materiálom v tuhej fáze pri potlači patrí NC membrána, DBM, DDT, nylonová membrána, PVDF atď. Vyberáme PVDF (polyvinylidénfluorid), ktorý má lepšiu adsorpciu bielkovín, fyzikálnu pevnosť a lepšiu chemickú kompatibilitu.Existujú dve špecifikácie: immobilon-p (0,45 um) a immobilon PSQ (0,2 um pre MW < 20 kDa).

Polosuchá metóda

To znamená, že kombinácia gélovej medzivrstvy je umiestnená medzi filtračný papier s prenosovým tlmivým roztokom a prúd je vedený cez tlmivý roztok adsorbovaný na filtračnom papieri, aby sa dosiahol prenosový efekt.Pretože prúd pôsobí priamo na lepidlo fólie, podmienky prenosu sú pomerne drsné, ale čas prenosu je krátky a účinnosť je vysoká.

(1) výber experimentálnych podmienok

Prúd je 1ma-2ma / cm2 a zvyčajne používame 100 mA / membránu.Čas prenosu môže byť zvolený podľa veľkosti molekuly cieľového proteínu a koncentrácie gélu a môže byť vhodne upravený podľa aktuálnej situácie.

Veľkosť molekuly cieľového proteínu (kDa), koncentrácia gélu a čas prenosu

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12 % 0,75

<20 15 % 0,5

(2) experimentálna prevádzka

(1) Príprava filtračného papiera a membrány (príprava sa začne 20 minút pred elektroforézou).

A. Skontrolujte, či je dostatok prenosových pufrov, ktoré nie sú pripravené okamžite.

B. Skontrolujte, či je filtračný papier a membrána správnej veľkosti.

C. Ponorte membránu do metanolu asi na 1-2 minúty.A potom sa prenesie do prenosovej vyrovnávacej pamäte.

D. Namočte príslušný adhezívny filtračný papier a membránový filtračný papier do prenosového pufra.

Ako dlho by mala membrána PDVF nasiaknuť metanolom pri vstupe do prenosového pufra?

PVDF je hydrofóbny a je ťažké ho namočiť do prenosového pufra.Po úprave metanolom sa ľahšie namáča.Predúprava PVDF je namočiť a aktivovať metanolom a potom ho po dôkladnom namočení dvakrát premyť destilovanou vodou.Účelom použitia metanolových bublín je aktivovať kladne nabité skupiny na PVDF membráne a uľahčiť ich naviazanie na negatívne nabité proteíny.

Ľudia ho zvyčajne používajú 5-20 minút.Môže sa namočiť súčasne s naberaním lepidla a odhadom to bude trvať asi 5 minút.Efekt nie je zlý.V minulosti niektorí weboví priatelia písali, že na čase spracovania príliš nezáleží, ale kľúčová bola kvalita filmu.To je pravda.Pokiaľ je membrána úplne premočená, malo by to byť OK.

Špecifikácia PVDF spoločnosti Hybond znie nasledovne: "predom zvlhčenie membrány pri 100 % metanolu (10 sekúnd)".Chápem to tak, že je v poriadku namočiť aspoň 10 sekúnd.V skutočnosti je v poriadku namočiť na 10 sekúnd alebo 10 minút.

(2) Prevod

A. Položte spodný filtračný papier na elektrický prenosový nástroj.Vo všeobecnosti sa používajú tri vrstvy.

B. Položte membránu na filtračný papier proti membráne, dávajte pozor, aby medzi membránou a filtračným papierom neboli bubliny, a nalejte na membránu trochu prenosového pufra, aby bola membrána vlhká.

C. Odlepte lepidlo, odstráňte stohovací gél a opatrne ho presuňte na fóliu.

D. Odrežte ľavý horný roh fólie a ceruzkou označte polohu lepidla na fólii.

E. Zakryte kúsok filtračného papiera proti lepidlu na lepidle.Nalejte trochu prenosového pufra a položte dva kusy filtračného papiera.

F. Nainštalujte elektrický prenosový prístroj a vyberte požadovaný prúd a čas podľa potrieb.

G. Počas procesu prenosu sa musí kedykoľvek pozorovať zmena napätia a každá abnormalita sa musí včas upraviť.