Kouman yo itilize lakòl separasyon?- pati 1

Kouman yo itilize lakòl separasyon?

Western blot transfè manbràn

Anba aksyon aktyèl la, pwoteyin nan transfere soti nan jèl la nan konpayi asirans lan solid (manbràn).

Seleksyon manbràn: materyèl yo souvan itilize solid-faz nan anprent gen ladan manbràn NC, DBM, DDT, manbràn nilon, PVDF, elatriye Nou chwazi PVDF (polyvinylidene fliyò), ki gen pi bon adsorption pwoteyin, fòs fizik ak pi bon konpatibilite chimik.Gen de espesifikasyon: immobilon-p (0.45um) ak immobilon PSQ (0.2um pou MW <20kDa).

Yon metòd semi sèk

Sa vle di, konbinezon jèl la mete ant papye filtre a ak tanpon transfè a, epi aktyèl la fèt nan tanpon adsorbed sou papye filtre a pou reyalize efè transfè a.Paske aktyèl la aji dirèkteman sou lakòl fim nan, kondisyon transfè yo relativman piman bouk, men tan transfè a kout ak efikasite segondè.

(1) seleksyon kondisyon eksperimantal yo

Aktyèl la se 1ma-2ma / cm2, epi anjeneral nou itilize 100mA / manbràn.Tan transfè a ka chwazi dapre gwosè molekil pwoteyin sib la ak konsantrasyon jèl la, epi yo ka ajiste kòmsadwa selon sitiyasyon aktyèl la.

Sib gwosè molekilè pwoteyin (kDa), konsantrasyon jèl ak tan transfè

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) operasyon eksperimantal

(1) Preparasyon papye filtre ak manbràn (preparasyon dwe kòmanse 20 minit anvan elektwoforèz).

A. Tcheke si gen ase tanpon transfè, ki pa prepare imedyatman.

B. Tcheke si gen papye filtre ak manbràn nan gwosè apwopriye.

C. Plonje manbràn nan nan metanol pou apeprè 1-2 minit.Lè sa a transfere nan tanpon transfè a.

D. Tranpe papye filtre adezif ki apwopriye a ak papye filtre manbràn nan tanpon transfè a respektivman.

Konbyen tan manbràn PDVF a ta dwe tranpe nan metanol lè w ap antre nan tanpon transfè a?

PVDF se idrofob, epi li difisil pou tranpe nan tanpon transfè a.Apre tretman metanol, li pi fasil pou tranpe.Pretreatman PVDF se tranpe ak aktive li ak metanol, ak Lè sa a, lave li de fwa ak dlo distile apre tranpe byen.Objektif pou sèvi ak bul metanol se aktive gwoup yo chaje pozitivman sou manbràn PVDF la epi fè li pi fasil yo mare ak pwoteyin negatif chaje.

Moun anjeneral sèvi ak li pou 5-20 minit.Li ka tranpe an menm tan ak pran lakòl la, epi li estime ke li pral pran apeprè 5 minit.Efè a pa move.Nan tan lontan, kèk webfriends afiche ke tan an pwosesis pa t 'gen pwoblèm anpil, men kle a se bon jan kalite a nan fim nan.Se vre.Osi lontan ke manbràn la konplètman tranpe, li ta dwe OK.

Hybond a PVDF spesifikasyon li jan sa a: "pre mouye manbràn nan nan 100% metanol (10 segonn)".Konpreyansyon mwen an se ke li nan OK tranpe pou omwen 10 segonn.An reyalite, li se OK tranpe pou 10 segonn oswa 10 minit.

(2) Transfè

A. Mete papye filtre pi ba a sou enstriman transfè elektrik la.Anjeneral yo itilize twa kouch.

B. Mete manbràn an sou papye filtre a kont manbràn an, peye atansyon pou pa gen bul ant manbràn an ak papye filtre a, epi vide kèk tanpon transfè sou manbràn an pou kenbe manbràn an mouye.

C. Retire lakòl la, retire jèl pil la epi ak anpil atansyon deplase li sou fim nan.

D. Koupe kwen anwo gòch fim nan epi make pozisyon lakòl la sou fim nan ak yon kreyon.

E. Kouvri yon moso papye filtre kont lakòl la sou lakòl la.Vide kèk tanpon transfè epi mete de moso papye filtre.

F. Enstale enstriman transfè elektrik la epi chwazi aktyèl ak tan ki nesesè yo selon bezwen yo.

G. Pandan pwosesis transfè a, yo dwe obsève chanjman vòltaj la nenpòt ki lè, epi yo pral ajiste nenpòt anòmal nan tan.