Як використовувати розділовий клей?- частина 1

Як використовувати розділовий клей?

Перенесення мембрани Вестерн-блот

Під дією струму білок переноситься з гелю на твердий носій (мембрану).

Вибір мембрани: твердофазні матеріали, які зазвичай використовуються для імпринтингу, включають NC мембрану, DBM, DDT, нейлонову мембрану, PVDF тощо. Ми обираємо PVDF (полівініліденфторид), який має кращу адсорбцію білків, фізичну міцність і кращу хімічну сумісність.Є дві специфікації: immobilon-p (0,45 мкм) та immobilon PSQ (0,2 мкм для молекулярної маси < 20 кДа).

Напівсухий спосіб

Тобто комбінація проміжних шарів гелю поміщається між фільтрувальним папером і буфером перенесення, і струм проводиться через буфер, адсорбований на фільтрувальному папері, для досягнення ефекту перенесення.Оскільки струм діє безпосередньо на плівковий клей, умови перенесення є відносно суворими, але час перенесення короткий, а ефективність висока.

(1) вибір умов експерименту

Струм становить 1 ма-2 ма / см2, і ми зазвичай використовуємо 100 мА / мембрану.Час передачі може бути обраний відповідно до розміру цільової молекули білка та концентрації гелю, і може бути належним чином скоригований відповідно до фактичної ситуації.

Розмір молекули цільового білка (кДа), концентрація гелю та час перенесення

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) дослідна експлуатація

(1) Підготовка фільтрувального паперу та мембрани (підготовку слід починати за 20 хвилин до електрофорезу).

A. Перевірте, чи достатньо буферів перенесення, які не готуються відразу.

B. Перевірте, чи є фільтрувальний папір і мембрана належного розміру.

C. Занурте мембрану в метанол приблизно на 1-2 хвилини.А потім передається в буфер передачі.

D. Замочіть відповідний клейкий фільтрувальний папір і мембранний фільтрувальний папір у буфер для перенесення відповідно.

Як довго мембрана PDVF має замочуватись у метанолі перед входом у буфер перенесення?

PVDF є гідрофобним, і його важко замочити в буфері для перенесення.Після обробки метанолом його легше замочувати.Попередня обробка ПВДФ полягає в тому, щоб замочити та активувати його метанолом, а потім двічі промити дистильованою водою після ретельного замочування.Метою використання бульбашок метанолу є активація позитивно заряджених груп на мембрані PVDF і полегшення зв’язування з негативно зарядженими білками.

Люди зазвичай використовують його протягом 5-20 хвилин.Його можна замочувати одночасно з прийомом клею, і орієнтовно це займе близько 5 хвилин.Ефект непоганий.Раніше деякі веб-друзі писали, що час обробки не має великого значення, але ключовою була якість фільму.Це правда.Поки мембрана повністю просякнута, все повинно бути в порядку.

Специфікація Hybond PVDF звучить так: «попередньо змочіть мембрану в 100% метанолі (10 секунд)».Я розумію, що нормально замочувати принаймні 10 секунд.Насправді можна замочити 10 секунд або 10 хвилин.

(2) Передача

A. Покладіть нижній фільтрувальний папір на електропереносний інструмент.Зазвичай використовують три шари.

B. Покладіть мембрану на фільтрувальний папір навпроти мембрани, стежте за тим, щоб між мембраною та фільтрувальним папером не було бульбашок, і налийте трохи буфера для перенесення на мембрану, щоб мембрана залишалася вологою.

C. Зніміть клей, видаліть стек-гель і обережно перемістіть його на плівку.

D. Відріжте лівий верхній кут плівки та позначте місце клею на плівці олівцем.

E. Накрийте шматок фільтрувального паперу проти клею на клеї.Налийте трохи буфера для перенесення та покладіть два шматки фільтрувального паперу.

F. Встановіть інструмент електричного перенесення та виберіть необхідний струм і час відповідно до потреб.

G. Під час процесу передачі зміна напруги повинна спостерігатися в будь-який час, і будь-яка аномалія повинна бути скоригована вчасно.